Drosophila melanogaster

Transkript

1 Modul biol113 Zellbiologie Drosophila melanogaster Komponenten der angeborenen Immunabwehr

2 Experimente 1) RT (Reverse Transkriptase)-PCR zum Nachweis einer AMP- Expression nach Infektion 1.1 PCR-Reaktion 1.2 Gel-Elektrophorese (klassisch) 2) LacZ-Färbung infizierter Drosophila- Larven

3 Versuchsansatz Kontrolle Infektion 24 h Analysen 1) Änderungen in den Transkriptmengen antimikrobieller Peptidgene à RT-PCR 2) Histologische Analyse der induzierten Expression antimikrobieller Peptidgene mittels Reporterstämmen à Enzymfärbung

4 1) Kontrolle Infektion mrna mrna ss-cdna ss-cdna RT-PCR RT-PCR

5 Kontrolle Infektion mrna mrna ss-cdna ss-cdna RT-PCR RT-PCR

6 3 unterschiedliche cdnas als Template A B C RT-PCR wird pipettiert (ACHTUNG 6 Reaktionen in kleinen Tubes) Kontrollgen = rpl32 AMPgen = dipt PCR-reaktion 45 min PCR-Proben für das Gel vorbereiten (+5 µl Ldye pro Reaktion) Gel laufen lassen (ca. 20 min) & analysieren

7 DNA-Elektrophorese Ethidiumbromid Ethidium bromide

8 DNA-Elektrophorese Alternative Färbung mit MidoriGreen Anregung mit blauem Licht Direkte Ansicht der Proben Ungiftig, nicht mutagen ABER: Nitrilhandschuhe verwenden Sie bitte trotzdem zur Sicherheit.

9 Analytische Gelelektrophorese µl PCR Produkt inkl. Ladepuffer 2. Geben Sie DNA-Mix in die Taschen des Gels 3. Legen Sie ein Spannungsfeld an. Run to Red (Anode +) 4. Aufnahme des Gels

10 Ablauf/Pipettierschema RT-PCR 1 Mastermix vorbereiten Menge Substanz 2 Eppis beschriften 6 Tubes á 0,2 ml 6 4 1,5 ml Probe A B C je 2 µl 70 µl 5 X-Puffer 14 µl dntps (2,5 µm each) 3,5 µl Taq-Polymerase 220 µl H 2 O Auf EIS halten!!!! 5 Kontrollgen LDye je +5 µl rpl32 44 µl DECKEL auch beschriften AMPgen dipt R = rpl32 je 10 µl 1-A-R 7 Primerpaarung Probe Gruppennummer D = dipt 3 RS RAS Primer DS DAS je 0,5 µl

11 Pipettierschema Gelelektrophorese Kammer 1 50bp 50bp rpl32 dipt rpl32 dipt Gruppe 1 Gruppe 2 50bp 50bp rpl32 dipt rpl32 dipt Gruppe 3 Gruppe 4 50bp 2 µl je 10 µl (inkl. LDye)

12 Pipettierschema Gelelektrophorese Kammer 2 50bp 50bp rpl32 dipt rpl32 dipt Gruppe 5 Gruppe 6 50bp 50bp rpl32 dipt rpl32 dipt Gruppe 7 Gruppe 8 50bp 2 µl je 10 µl (inkl. LDye)

13 Versuchsansatz Dipt-Promotor Lac-Z (ß-Galactosidase) Kontrolle Infektion I Infektion II 24 h 24 h

14 LacZ-Färbung X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-Dgalactopyranosid 5-Brom-4-chlor-indoxyl 5, 5 -Dibrom-4,4 -dichlor-indigo Blauer Farbniederschlag ß-Galaktosidasen spalten ß-glycosidische Bindungen X-Gal ist ein Farbstoff, der nach Umsetzung einen blauen Niederschlag liefert

15 3 unterschiedliche Schalen/Proben mit Larven 1 a) b) c) d) e) f) 2 3 Färbelösung ansetzen Larven präparieren (aufreißen, Gewebe freilegen) Fixieren der Larven (ca. 20 min) Waschen mit Puffer (2-3 X) Färben mit Färbelösung Analysieren/Skizzieren Dipt-Promotor Lac-Z (ß-Galactosidase)

16 Ablauf LacZ-Färbung 1 Färbelösung vorbereiten 2 Fixierlösung vorbereiten 300 µl 3 Gewebe präparieren 4 20 min fixieren 6 Färbung 37 C (5-10 min) je 300 µl 5 1xPBS Waschen 3x 5 min je 300 µl 1

17 Zeitplan 1) Vorbesprechung 2) Ansetzen der PCR 3) Start der PCR 4) X-Gal in die Färbelösung geben (37 C) 5) Präparation der Gewebe für die histologische Analyse 6) Fixierung der Gewebe (15-20 min) 7) Waschen der Gewebe (3 X 2 min) 8) Färbelösung auf die Gewebe (s.4) 9) Vorbereitung der PCR-Proben für die DNA Elektrophorese 10) Beladen der Gele (Gele laufen lassen) 11) Analyse der Färbungen 12) Analyse der Gele

18 Modul biol113 Zellbiologie Drosophila melanogaster Komponenten der angeborenen Immunabwehr NACHBESPRECHUNG

19 cdna-sythese (mittels RT) & anschließende PCR = hier RT-PCR

20 Unterschiede: PCR Drosophila vs PCR C. elegans Einsatz des Templates Drosophila PCR - cdna (aus mrna geschrieben) C.ele. PCR - genomische DNA PCR mit cdna Ermöglicht die Analyse exprimierter Gene Überprüfung ob Transkripte vorhanden sind PCR mit gdna Ermöglicht genomische Unterschiede zu identifizieren z.b. Deletionen, Duplikationen

21 Auswertung Gelelektrophorese rpl32 dipt 50bp A B C A B C

22 Auswertung Gelelektrophorese rpl32 dipt 50bp A B C A B C

23 Auswertung LacZ-Färbung???

24 Auswertung LacZ-Färbung keine bis leichte Färbung Färbung im Darm Färbung des Fettkörpers

25 Auswertung LacZ-Färbung keine bis leichte Färbung Färbung im Darm Färbung des Fettkörpers???

26 Auswertung LacZ-Färbung keine bis leichte Färbung Färbung im Darm Färbung des Fettkörpers nur geringe Konz. an AMPS Orale Infektion LOKALE IA Infektion Hämolymphe SYSTMISCHE IA

27 Auswertung LacZ-Färbung keine bis leichte Färbung Färbung im Darm Färbung des Fettkörpers nur geringe Konz. an AMPS Orale Infektion LOKALE IA Infektion Hämolymphe SYSTMISCHE IA

28 Immunabwehr in Drosophila - ein kleiner Überblick zum Schluss - NUR ein angeborenes Immunsystem vorhanden Unterscheidung in à Humorale Abwehr AMPs ROS à Zelluläre Abwehr ROS Plasmatozyten (Phagozytose) Lamellozyten (Einkapselung) Kristallzellen (Melanisierung) Abbildungen-The Host Defense of Drosophila melanogaster Bruno Lemaitre & Jules Hoffmann, 2006