Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie- Grundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung Teil V. Peter Schmieder AG NMR

Transkript

1 Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie- Grundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung Teil V

2 Das Programm 2/96 Beim letzten Mal Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie COSY, DQF-COSY und Phasencyclen DQF-COSY von Menthol

3 Das Programm 3/96 Heute Heteronukleare NMR Ein Beispiel

4 4/96 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie

5 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 5/96 2D-NMR Sequenzen enthalten zwei neue Elemente: Evolutionszeit und Mischzeit Preparation Evolution Mischung Detektion (t ) (t 2 ) Evolution: Erzeugen einer weiteren Frequenzachse durch indirekte Detektion Mischung: Transfer von Magnetisierung von Spin zu Spin über Wechsel- Wirkungen zwischen Spins

6 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 6/96 Man nimmt einen zweidimensionalen FID auf

7 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 7/96 Die erste FT ergibt ein Interferogram

8 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 8/96 Die zweite FT ergibt ein zweidimensionaler Spektrum

9 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 9/96 Zur Auswertung betrachtet man Contour-Plots, die Peakintensität als Höhenlinien darstellen

10 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 0/96 Zweidimensionale Experimente enthalten verglichen mit eindimensionalen zwei neu Elemente In der Evolutionszeit wird durch systematische Variation einer Wartezeit eine weitere, indirekte Zeitachse erzeugt, die sich durch FT in eine Frequenzachse umwandeln lässt In der Mischzeit findet ein Transfer von Magnetisierung von einem Spin zum anderen statt. Je nach der Art des Transfers (homonukleare oder heteronukleare Kopplung, NOE) entstehen unterschiedliche Spektren

11 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie /96 Während der Mischzeit wird also Magnetisierung zwischen Spins ausgetauscht. Hauptsächlicher Mechanismus ist die J-Kopplung, entweder zwischen gleichen Spins (homonukleare Kopplung) oder andersartigen Spins (heteronukleare Kopplung).

12 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 2/96 homonukleare Spektren Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: Kreuzsignal Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung: Diagonalsignal Transfer H H 2 δ 2 δ δ δ 2 Kreuzsignal Diagonalsignal

13 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 3/96 ppm Ein Beispiel war das DQF-COSY ppm

14 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 4/96 heteronukleare Spektren Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide H Transfer X Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. δ C2 Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der δ C3 chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann δ H δ H2 δ H3 δ C ergibt sich kein Signal.

15 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 5/96 Auf den beiden Frequenzachsen des zweidimensionalen Spektrums werden zwei unterschiedliche chemische Verschiebungen (δ H, δ X ) dargestellt Die Auflösung in den beiden Dimensionen ist nicht gleich, in der indirekten Dimension ist sie wesentlich schlechter als in der detektierten Dimension Es macht also einen Unterschied, welche chemische Verschiebung in welcher Dimension detektiert wird: Es gibt herkömmliche und inverse heteronukleare Spektren

16 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie 6/96 Ob ein Transfer stattfindet hängt von der Größe der Kopplungskonstanten ab und kann auch durch die Pulssequenz beeinflusst werden Mit Kopplungen < Hz ist kein Transfer möglich Kopplungen über eine Bindung sind größer als über mehrere Bindungen J HH = 276 Hz 2 J HH = Hz 3 J HH = Hz 4 J HH = Hz J HC = Hz 2 J HC = Hz 3 J HC = Hz 4 J HC = Hz J HN = Hz 2 J HN = Hz 3 J HN = Hz 4 J HN = 0.. Hz

17 7/96 Man kann daher bei heteronuklearen Spektren zwischen Korrelationen über die direkte Kopplung über eine Bindung und über Weitbereichskopplungen unterscheiden Korrelation via J XH Korrelation via n J HX C-Detektion HETCOR COLOC H-Detektion HMQC HMBC herkömmliche inverse

18 8/96 Ausgangspunkt für ein heteronukleares 2D kann die INEPT-Sequenz sein H /2 /2 2 /2 2 /2 Entkopplung n X Hier liegt transversale Protonen-Magnetisierung vor, man kann eine Evolutionszeit einbauen...

19 9/96 In der resultierenden Sequenz tritt in der Evolutionszeit heteronukleare Kopplung auf H t /2 /2 2 /2 2 /2 Entkopplung n X Die ist natürlich nicht wünschenswert, wie kann man sie entfernen?

20 20/96 Mit einem 80 Puls im HETCOR H t /2 t /2 /2 /2 2 /2 2 /2 Entkopplung n X δ H,J HH aber kein J HX INEPT-Sequenz = /2 J HC, 2 = /3 J HC

21 2/96 HETCOR (oder H,C-COSY) H t /2 /2 t /2 /2 2 /2 2 /2 Entkopplung n X Die beiden Pulse kann man zu einem zusammenfassen, Damit verringert man die Fehleranfälligkeit des Experimentes

22 22/96 δ X δ H Im H,C-COSY (oder auch HETCOR) sind nur Korrelationen zwischen Protonen und direkt daran gebundenen Kohlenstoffen zu sehen, so wie im INEPT oder DEPT nur protonentragende Kohlenstoffe erscheinen

23 23/96 Das kann man auch ausgehend vom DEPT machen x 80 x θ y H Entkopplung 90 x 80 x n X Hier liegt transversale Protonen-Magnetisierung vor, man kann eine Evolutionszeit einbauen...

24 24/96... und erhält das DEPT-COSY 90 x 80 x θ y H t /2 t /2 Entkopplung 80 x 90 x 80 x n X δ H,J HH aber kein J HX DEPT-Sequenz = /2 J HC

25 25/96 ppm 2.0 H,C-COSY ppm 2.0 DEPT-COSY ppm ppm

26 26/96 Weitbereichskorrelation H t /2 t /2 /2 /2 2 /2 2 /2 Entkopplung n X Um nicht nur Korrelationen via J HC zu bekommen muss man die Delays und 2 länger machen, damit man in die Größenordnung von /2 n J HC kommt

27 27/96 Um die Pulssequenz nicht zu lang werden zu lassen und um die Zahl der Pulse zu reduzieren fasst man die Evolutionszeit (t ) und die Entwicklung der Kopplung während des Delays zusammen. Es entsteht ein constant time Experiment, das seinen Namen trägt, weil sich die Länge der Sequenz durch die Evolutionszeit nicht ändert. Wie bekommt man nun aber die fürs 2D notwendige Evolution?

28 28/96 H +t /2 -t /2 n X J HH entwickelt sich ungestört: ( +t /2) + ( -t /2) = muss kleiner /2J HH sein J HC entwickelt sich ungestört: ( +t /2) + ( -t /2) = sollte nah an /2 n J HC sein δ H wird refocussiert, hier gilt ( +t /2) - ( -t /2) = t

29 29/96 So entsteht das H,C-COLOC H ( +t )/2 ( -t )/2 2 /2 2 /2 Entkopplung n X = 25 msec, 2 = 33 msec

30 30/96 ppm 2 H,C-COSY ppm 2 H,C-COLOC ppm ppm

31 3/96 Die Empfindlichkeit der Messung hängt von mehreren Faktoren ab Magnetic Moment Spin Angular Momentum S/N ~ (γ p B 0 ) (γ d )( γ d B ) 0 γ H ~ 4 γ C, die Detektion auf Protonen bringt also einen Faktor 8!!

32 32/96 Aus diesem Grund werden das HETCOR und das COLOC heute kaum mehr verwendet. Sie sind fast vollständig von ihren sogenannten inversen Analogen ersetzt worden. Im Falle der D-Spektren sind dagegen 3C- Spektren und DEPT heute noch sehr aktuell

33 33/96 HMQC (inverses H,X-COSY) 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung Preparation Evolution Mischung Detektion

34 34/96 keine chemische Verschiebung δ H, Kopplung J HH zu vernachlässigen: sin πj HH = 0.06 (J=3 Hz, =3.5msec) 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung Kopplung J HX = /(2 J Hx ) typisch bei 3 C 3.5 msec chemische Verschiebung δ X keine chemische Verschiebung δ H was ist mit der Kopplung J HX?

35 Produktoperatorformalismus 35/96 H 2 H 2 n X n X Diesen building block haben wir schon anders herum berechnet, der 80 Puls entfernt die heteronukleare Kopplung, J HX wird refocussiert

36 36/96 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung 90 H x H z -H y πj HX -H y cos πj HX + 2H x X z sin πj HX = 3.5 msec, J HX = 40 Hz J HX * = 0.5 cos πj HX = cos 0.5 π = 0, sin πj HX = sin 0.5 π = aber keine Weitbereichskopplung = 3.5 msec, J HX = 5 Hz sin πj HX = sin π = 0.05

37 37/96 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung 90 X x 2H x X z -2H x X y δ C t Multiquanten -2H x X y cos δ X t + 2H x X x sin δ X t nicht detektierbar 90 X x -2H x X z cos δ X t + 2H x X x sin δ X t

38 38/96 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung πj HX -2H x X z cos δ X t -H y cos δ X t zu Beginn der Acquisition liegt Protonenmagnetisierung vor, moduliert mit der chemischen Verschiebung des direkt gebundenen Heterokerns

39 39/96 HMQC = Heteronuclear MultipleQuantum Correlation δ X Ein Signal zeigt die direkte Bindung zwischen H und X an. δ H Die Kopplung zwischen H und X ist nicht zu sehen, während der Evolution und der Acquisition wird entkoppelt

40 40/96 Was ist eigentlich mit den Protonen die nicht an den Kern gebunden sind, z.b. an 2 C für X = C? H 2 C H 99% % 3 C keine chemische Verschiebung δ H Kopplung J HH zu vernachlässigen -H y 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung

41 4/96 99% δ C J HC 0,5% δ H 99% δ H % δ H Die Signale müssen irgendwie entfernt werden

42 42/96. Molekül mit 3 C markieren (unrealistisch) 2. Phasencyclus 3. Gradienten 4. BIRD-Puls (später)

43 43/96 Phasencyclus 90 x 80 x H φ rec 90 φ 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung φ = x, -x φ rec = +, - Das Experiment wird mehrmals mit unterschiedlichen Puls- und Receiverphasen durchgeführt

44 44/96 nicht an X-gebundene Protonen: : φ = x H y 2: φ = -x H y 2 = 0 n X-gebundene Protonen : : φ = x H y cos δ X t 2H x X z 90 X x -2H x X y 2: φ = -x -H y cos δ X t } - 2 = 2 H y cos δ X t 2H x X z 90 X -x 2H x X y

45 45/96 Allerdings hat die Unterdrückung mit dem Phasencyclus zwei Nachteile: Es ist ein Differenzexperiment. Sollte die Subtraktion der beiden Spektren nicht ideal funktionieren, bleibt ein starkes Restsignal. Man nimmt das starke Signal auf jeden Fall auf, der Empfänger muss dementsprechend weit geöffnet werden und es bleibt weniger Platz für die gewünschten kleineren Signale.

46 46/96 Gradienten Probe Spule Hauptfeld Gradient z Gradienten stellen kontrollierte Störungen der Homogenität des Hauptmagnetfeldes dar Die Stärke des Magnetfeldes und damit die Resonanzfrequenz wird damit von der Position des Moleküls in der Spule abhängig B = ( + z) B 0 ω = - γ B = - γ ( + z) B 0

47 47/96 H τ Normalerweise ist die chemische Verschiebung eines speziellen Kerns in allen Molekülen in der Probe gleich, alle Signale addieren sich auf

48 48/96 H τ G z z Im Falle eines Gradienten ist die chemische Verschiebung vom Ort abhängig, die Signale addieren sich zu 0

49 49/96 Die chemische Verschiebung ist bei unterschiedlichen Kernsorten unterschiedlich. Wir erinnern uns auch, das sie in mehrdimensionalen Experimenten von einer Kernsorte zur nächsten transferiert werden konnte. z

50 50/96 Wie kann man Gradienten konstruktiv einsetzten? H /2 /2 G z : Wir wissen, daß ein 80 Puls die chemische Verschiebung refocussiert, er beseitigt also auch den Effekt von zwei gleichen Gradienten

51 5/96 Wie kann man Gradienten konstruktiv einsetzten? H /2 /2 G z : - Gradienten können aber auch umgekehrte Vorzeichen haben und sich dann gegenseitig aufheben

52 52/96 Das funktioniert auch, wenn zwei Kernsorten involviert sind H /2 /2 /2 /2 n X G z Magnetisierung die den ersten Gradienten nicht erfahren hat wird durch den zweiten zerstört und umgekehrt, es bleibt nur was beide Gradienten gespürt hat

53 53/96 H /2 /2 /2 /2 n X G z γ X : - γ H Während des ersten Gradienten ist chemische Verschiebung der Protonen aktiv, während des zweiten die von X-Kernen. Dieser Unterschied wird durch einen entsprechenden Unterschied in der Stärke der Gradienten ausgeglichen.

54 54/96 Im HMQC funktioniert das auch H t /2 t /2 3 C Multiquanten H-Singlequanten G z -4 5 : 3

55 55/96 Bei der Wahl der drei Gradienten muss man die unterschiedlichen gyromagnetischen Verhältnisse berücksichtigen und die Magnetisierung die zur Zeit des Gradienten vorliegt. Liegt einfache transversale Magnetisierung in x oder y Richtung vor (Singlequanten), so ist die chemische Verschiebung der jeweiligen Kernsorte relevant. Bei Multiquanten addieren sich die chemischen Verschiebungen, man kann die Effekte getrennt betrachten, muss am Ende aber addieren.

56 56/96 Für die Protonen sieht das so aus: H t /2 t /2 G z 5 : 3 Der 80 Puls refocussiert chemische Verschiebung, die beiden Gradienten sind aber nicht gleich stark, es bleibt etwas zurück: 5 3 = 2 Das ganze noch multipliziert mit γ H!!

57 57/96 Für die Kohlenstoffe ist es einfacher: 3 C t /2 t /2 G z 5 : 3 Hier wird nicht refocussiert, die beiden Gradienten addieren sich auf: = 8 Diesmal noch multipliziert mit γ C!!

58 58/96 Damit sind wir bei H t /2 t /2 3 C G z 5 : 3 8 * γ C + 2 * γ H 4 * γ C = γ H 4 * γ H Wir haben nun alles in γ H umgerechnet

59 59/96 Der dritte Gradient muss alles wieder rückgängig machen, hier sind nur die Protonen aktiv, also brauchen wir - 4 * γ H H t /2 t /2 3 C G z 5 : 3 : - 4

60 60/96 Damit ist unser HMQC fertig H t /2 t /2 3 C G z 5 : 3 : - 4 Da die Protonen an 2 C die Auffächerung aufgrund der Kohlenstoffmagnetisierung nicht erfahren, werden sie von den Gradienten vollständig gelöscht!

61 6/96 Durch die Wahl unserer Wartezeiten ( = /2( J HX )) haben wir nur Korrelationen über eine Bindung detektiert, solche über mehrere Bindungen sind aber auch von großer Bedeutung in der Strukturaufklärung. Deshalb gibt es als inverses Analogon zum COLOC das HMBC, das die n J HX Kopplungen nutzt

62 62/96 Wie kann man das HMQC das Kopplungen über mehrere Bindungen detektierbar werden umbauen, d.h. zum HMBC umbauen? 90 x 80 x H 90 φ 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung

63 63/96 HMBC (Weitbereichskorrelation) 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2

64 64/96 H n X Im ersten Teil der Pulssequenz werden die Multiquanten erzeugt, indem sich die heteronukleare Kopplung während entwickelt. 90 H x Hz -H y πj HX -H y cos πj HX + 2H x X z sin πj HX 90 X x -H y cos πj HX -2H x X y sin πj HX wird mit dem Phasencyclus entfernt Multiquanten bilden sich optimal für = /2J

65 65/96 Die optimale Länge hängt also von der Größe der Kopplung ab und läßt sich leicht berechnen 90 x 80 x H 90 φ 90 x n X t /2 t /2 Entkopplung Eigentlich muss man also nur länger machen HMQC: J = 40 Hz, = /2J = 3.57 msec HMBC: J = 6 Hz, = /2J = 83 msec

66 66/96 Dann treten aber zwei Probleme auf: Entwicklung von J HH -Kopplung Relaxation 90 x 80 x H Die Relaxation bewirkt das Verschwinden des Signals, Die Zeit vor der Acquisition sollte also so lang wie nötig aber so kurz wie möglich sein, möglichst klein

67 67/96 Die Entwicklung von J HH ist nicht mehr zu vernachlässigen, es entsteht eine Mischung von in-phase und anti-phase Magnetisierung Eine Magnitude-Rechnung wird nötig sein! 90 x 80 x H H y cos πj HH 2-2H x H 2z sin πj HH 2 = 3.5 msec = 40 msec J HH = 3 Hz cos = 0.94 cos = 0.3 sin = 0.06 sin = 0.68

68 68/96 H 90 x 80 x Zur Erinnerung: Der 80 Puls hat im HMQC die chemische Verschiebung refocussiert. Wäre das nicht passiert, wäre eine Phasenkorrektur ebenfalls unmöglich. J HH war im HMQC nicht wichtig da zu kurz war. Wenn nun aber wegen J HH eine Magnitude-Rechnung gemacht werden muss, brauchen wir auch die chemische Verschiebung nicht mehr beachten.

69 69/96 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Man macht = msec lang, dann entwickelt sich heteronukelare Weitbereichskopplung lange genug

70 70/96 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Wegen der nun auftretenden homonuklearen Kopplung muss eine Magnitude-Rechnung gemacht werden, wir lassen dann auch chemische Verschiebung während zu, aber nicht während t!!!

71 7/96 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2 Die heteronukleare Kopplung wird auch nicht mehr refokussiert um Zeit zu sparen, die Entkopplung muss dann wegfallen, sonst bleibt kein Signal übrig.

72 72/96 Zu Beginn der Acquistion liegt also ein wildes Gemisch von Magnetisierung vor, wichtig ist die Modulierung mit der chemischen Verschiebung in t, den Rest erledigt die Magnitude-Rechnung. 90 x 80 x H 90 x 90 x n X t /2 t /2

73 73/96 Auch hier kann man wieder Gradienten benutzen um 3 C-gebundene Kerne zu selektieren H t /2 t /2 G 3 C G z 5 : 3 : -4

74 74/96 Was ist mit der J HX -Kopplung? Die daraus resultierenden Signale kennt man schon, wegen der fehlenden Entkopplung ergeben sich Doubletts Man könnte entweder auf /J setzte H y cos πj HX 2-2H x X z sin πj HX 2 =/J HX H y Oder man unterdrückt die Signale mit einem Phasecyclus

75 75/96 90 x 80 x H 2 φ rec 90 φ 90 φ2 90 x n X t /2 t /2 = 3.6 msec, 2 = 60 msec φ = x, x, -x, -x φ 2 = x, -x, x, -x φ rec = +, -, +, - } low-pass-j -Filter normaler Phasencyclus

76 76/96 HMBC = Heteronuclear MultipleBond Correlation Es bleiben nicht unterdrückte Signale von den J HC übrig als kleine Doubletts, andere Signale zeigen Weitbereichskopplung an HMQC HMBC Transfer via J HX δ X Transfer via n J HX = via J HX δ H δ H

77 77/96 Ein Beispiel

78 Ein Beispiel 78/96 Das Molekül C H 3 N 2 O 3 Br Desoxythymidin

79 Ein Beispiel 79/96 Die Experimente D- H min D- 3 C h DEPT COSY 0 min 0 min 3 C-HMQC 0 min 3 C-HMBC 50 min 5 N-HMQC 3 h 5 N-HMBC 35 h

80 Ein Beispiel 80/96 D- H-Spektrum C H 3 N 2 O 3 Br H/D H 2 O H/D DMSO 2 2

81 Ein Beispiel 8/96 D- 3 C-Spektrum C H 3 N 2 O 3 Br

82 Ein Beispiel 82/96 DEPT-Spektrum C H 3 N 2 O 3 Br D- 3 C-Spektrum

83 Ein Beispiel 83/96 COSY Zuckerbereich oder 8, nicht unterscheidbar Korrelation von Frequenzen via H- H- Kopplung, i.a. nur zwei oder drei Bindungen

84 Ein Beispiel 84/96 DMSO H 2 O 2 COSY H/D 5 OH OH

85 Ein Beispiel 85/96 3 C-HMQC Zuckerbereich /8 6 Basenbereich Korrelation von Frequenzen via H- 3 C-Kopplung, man korreliert nur direkt aneinander gebundene Kerne

86 Ein Beispiel 86/96 2 D- 3 C-Spektrum 6 7/8 7/

87 Ein Beispiel 87/96 3 C-HMBC Zuckerbereich Basenbereich Korrelation von Frequenzen via H- 3 C-Kopplung, man korreliert über bis zu 4 Bindungen ( 2 J HC bis 4 J HC ), J HC gibt ein Dublett

88 Ein Beispiel 88/96 = via J HC 7/ C-HMBC (Basenbereich) 7/ Korrelation ausgehend von H Korrelation zu 5 ist schwach und 5 ist von 7/8 aus zu sehen.

89 Ein Beispiel 89/ C-HMBC (Basenbereich) 5 Hier muss 7 sein Korrelation ausgehend von H3 C2 fehlt!!

90 Ein Beispiel 90/ C-HMBC (Basenbereich) Korrelation ausgehend von H7, das via H3 zugeordnet ist.

91 Ein Beispiel 9/ C-HMBC (Basenbereich) Korrelation ausgehend von H8, das via H3/H7 zugeordnet ist.

92 Ein Beispiel 92/ C-HMBC (Basenbereich) Korrelation ausgehend von H6, alles ist zu sehen, das hilft nicht beim Zuordnen, es passt aber alles.

93 Ein Beispiel 93/96 ppm 42 5 N-HMQC ppm

94 Ein Beispiel 94/96 ppm N-HMBC ppm

95 Ein Beispiel 95/96 Zuordnung H [ppm] 3 C [ppm] 5 N [ppm] 3 C [ppm] 3 C [ppm] 5 N [ppm] predicted dt dt ' 6,6 84,5 - ' 77,8 ± 8,2 85, - 2' 2,7 39,8-2' 39,9 ± 5, 40,4-3' 4,27 69,9-3' 68,7 ±,6 7,7-4' 3,79 87,5-4' 74,8 ± 9,2 88,4-5' 3,62 6-5' 63,8 ± 0,3 62, , ,7 2-49,2-2 56,8 ± 0,6 5,6-3,92-57, ,5 4-6,6-4 35,7 ± 6,9 37, ,7-5 7,5 ± 3, 0,5-6 8,09 39,4-6 35,7 ±,4 64,9-7 6,87 29,9-7 32,6 ± 6, ,25 06,5-8 89,4 ± 5,8 - -

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