Abkürzungsverzeichnis. 1. Einleitung Material und Methoden 8

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1 Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis VI 1. Einleitung Stabilisierung von Makromolekülen Natürliche Umgebungen von Proteinen Künstliche Umgebungen von Proteinen Ziel der vorliegenden Arbeit 6 2. Material und Methoden Organismen und Plasmide Verwendete Oligonukleotide Nährmedien Zellanzucht Anzucht von E. coli Stammkulturen Bestimmung von Wachstumsparametern Herstellung zellfreier Extrakte Zellernte Zellaufschluss Proteinbestimmung Methoden für das Arbeiten mit DNA Behandlung von Geräten und Lösungen Präparation genomischer DNA Präparation von Plasmid-DNA Analytische Plasmidisolierung aus E. coli Präparative Plasmidisolierung Reinheitskontrolle und Konzentrationsbestimmung von 17 DNA In vitro-amplifizierung von DNA-Fragmenten durch PCR Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation 20 I

2 2.8.7 Verdau von dsdna mit Restriktionsendonukleasen Dephosphorylierung von Vektor-DNA Agarose-Gelelektrophorese Analytische und präparative Agarose-Gelelektrophorese Isolierung von dsdna aus präparativen Agarose-Gelen Klonierung rekombinanter DNA in E. coli Ligation von dsdna-fragmenten Herstellung kompetenter E. coli-zellen Transformation von E. coli-zellen nach HANAHAN (1983) Kolonie-PCR-Screening Schnell-Screen von Plasmiden aus E. coli (Cracking) DNA-Sequenzierung Anreicherung und Aufreinigung rekombinanter 29 Proteine Expression der rekombinanten Proteine Aufreinigung der Proteine über Affinitätschromatographie Dialyse von Proteinen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach LAEMMLI 32 (1970) 2.11 COOMASSIE-Färbung von Proteinen Kopplung von Proteinen an Herstellung von durch Ultraschall (BARINAGA- 35 REMENTERIA RAMIREZ et al., 2000; mod.) Kopplung der AmyA und GUK1 über Streptavidin oder 36 Strep-Tactin (Linkerproteine) an 2.13 Elektronenmikroskopie Elektronenmikroskopische Trägernetze Kohlefolien Negativkontrastierung nach VALENTINE et al. (1968) Elektronenmikroskopische Abbildungen Größenbestimmung von Enzymaktivitätstests Amylase (AmyA) Enzymassay 40 II

3 Optisch-enzymatischer Test der Guanylatkinase 42 (AGARWAL et al., 1978) 2.15 Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme Experimente und Ergebnisse Herstellung der rekombinanten Plasmide Klonierung der amya Ergebnis der Sequenzierung der amya Klonierung der guk Ergebnis der Sequenzierung von 56 pjc20[strepn]guk1.1[1.3] 3.2 Expression und Aufreinigung der rekombinanten 57 Proteine Expression der AmyA Aufreinigung der AmyA mittels Affinitätschromatographie Expression der GUK Aufreinigung der GUK1 mittels Affinitätschromatographie Aktivitätstests der rekombinanten Proteine Enzymaktivität der AmyA Struktur der rekombinanten AmyA Enzymaktivität der GUK Herstellung von (DPPC bzw. DPPC/N- 65 Biotinyl-Cap-PE) 3.5 Kopplungsexperimente mit der rekombinanten AmyA Experimente zur Kopplung der AmyA über Streptavidin an 66 DPPC Nachweis der Kopplung (AmyA/Streptavidin/DPPC) Aktivitätstests zur Kopplung AmyA/Streptavidin/DPPC Einfluss von Harnstoff Einfluss von Betain Experimente zur Kopplung der AmyA über Strep-Tactin an DPPC- 77 III

4 Nachweis der Kopplung (AmyA/Strep-Tactin/DPPC) Aktivitätstests zur Kopplung AmyA/Strep-Tactin/DPPC Kopplung der AmyA über Streptavidin an DMPC Kopplungsexperimente mit der GUK Kopplung der GUK1 über Streptavidin an DPPC Nachweis der Kopplung (GUK1/Streptavidin/DPPC) Aktivitätstests zur Kopplung GUK1/Streptavidin/DPPC Kopplung der GUK1 über Streptavidin an DMPC Vergleich DPPC und DMPC mit Streptavidin Kopplung der GUK1 über Strep-Tactin an DPPC Nachweis der Kopplung (GUK1/Strep-Tactin/DPPC) Aktivitätstests zur Kopplung GUK1/Strep-Tactin/DPPC Kopplung der GUK1 über Strep-Tactin an DMPC Vergleich DPPC und DMPC mit Strep-Tactin Einfluss von Harnstoff Einfluss von Betain Kinetik der GUK1 im Vergleich Stabilitätstests der rekombinanten Enzyme Diskussion Beschaffenheit des verwendeten 102 Kopplungsmechanismus sowie der Matrix Aufreinigung der rekombinanten Enzyme AmyA und 103 GUK Kopplungsmechanismus Kopplungsmatrix AmyA-Struktur 107 IV

5 4.2.1 Orientierung der AmyA (im AmyA-Linkermolekül-Komplex) 111 an 4.3 Struktur und Orientierung der GUK Kopplung und Aktivität der AmyA und GUK Einfluss der Kopplung auf die Enzymaktivität der AmyA Einfluss der Kopplung auf die Enzymaktivität der GUK Einfluss von membranen auf die Aktivität der 117 GUK1 und AmyA 4.5 Einfluss von Harnstoff Einfluss von Betain Einflüsse einer definierten chemisch-physikalischen 129 Umgebung 4.8 Lipidmembranen als Schalter Zusammenfassung Literatur 135 V