Pharmazeutische Biologie WS2011/2012. Das neue Paradigma: Personalisierte Medizin

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1 3. Vorlesung Pharmazeutische Biologie WS2011/2012 Das neue Paradigma: Personalisierte Medizin Prof. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Biozentrum Max-von Laue-Str Frankfurt am Main Dingermann@em.uni-frankfurt.de 11/08/11

2 Single Nukleotid-Austausche Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Position regulatorische SNPs Nicht-synonyme SNPs Synonyme SNPs SNPs in Introns UTR-SNPs Effekte Aktivität der Transkription Proteinaktivität Proteinstabilität Proteininteraktion mrna-stabilität RNA-Spleißen Translationsaktivität RNA-Spleißen mrna- Stabilität Translationseffizienz (z.b. mirna- Bindung) Detektion Reporter- Assay EMSA qrt-pcr Allelische Expressionsimbalance Heterologe Expression Enzymkinetik Western-Blot Yeast Two-hybrid- System RNA-Stabilitätsanalyse Exon-Trapping Doppeltes Reporterspleißen RT-PCR Exon-Trapping Doppeltes Reporterspleißen RNA- Stabilitätsanalyse Western-Blot

3 Technologie zur SNP-Bestimmung

4 Einsatz von SNPs Als genetische Marker Zur Identifizierung und in der Forensik Zur Gen-Kartierung und in genome wide association studies (GWAS) zum Studium komplexer Krankheiten Zur Vorhersage einer Veranlagung für bestimmte Krankheiten Zum Nachweis eines Carrier-Status für monogene Erkrankungen Zur Genotypisierung von Probanden für klinische Studien Zur Vorhersage von Arzneimittelwirksamkeit und Arzneimittelverträglichkeit Für Abstammungsanalysen

5 Single Nukleotid-Austausche Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Ca Nukleotide im diploiden humanen Genom Ca gängige variable Positionen (SNPs) 1/500 Zwei Individuen unterscheiden sich in < SNPs 1/ % des humanen Genoms kodieren für Proteine SNPs liegen in kodierenden Bereichen (csnps) 1/ csnps führen zu einem AS-Austausch 1/ % des humanen Genoms haben regulatorische Funktion << SNPs haben einen (klinischen) Phänotyp << 1/ Jeder trägt zudem ca kürzlich eingefangene (Keimbahn)- Mutationen.

6 DNA-Mutationen als Folge von fehlerhafter Replikation Die Mutationsrate bei der DNA-Replikation beträgt grob 1 Fehler pro 10-9 Basen. 3 Mutationen pro haploidem Genom bzw. 6 Mutationen pro Zellteilung. 20 Zellteilungen liegen zwischen zwei Generationen von Eiern im Laufe der Keimbahnreifung. > 60 Mutationen Zellteilungen liegen zwischen zwei Generationen von Spermien im Laufe der Keimbahnreifung. > Mutationen

7 dbsnp SNP-relevante Datenbank ss# = Referenznummer des eingereichten (submitted) SNPs rs# = Referenznummer nach Abgleich mit ss# in der Datenbank

8 Single Nukleotid-Austausche Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Polymorphismen Selektion Gründer (Founder)-Effekt Die Gründerpopulation aller Menschen wird heute auf Individuen geschätzt. Fast alle heute vorhandenen SNPs stammen aus dieser Gründerpopulation.

9 Single Nukleotid-Austausche Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) The diploid genome sequence of an individual human. SNPs/ bp Ca. 6 SNPs/ Basen Rechnen würde man mit 10 SNPs/ Basen

10 Dezember 2007: SNPs = Breakthrough of the year

11 Das HapMap Projekt Man rechnet heute mit Positionen über alle humanen Genome, wo SNPs lokalisiert sind. Zwischen 2 Personen verschiedener Ethnien können bis zu Unterschiede zu finden sein. Zwei Personen mit gleichem ethnischem Background weisen ca. 0,1 0,15 % Unterschiede (3 5 Millionen gängige SNPs) auf.

12 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht A A X AA Aa weiblich A(p) a(q) Summe a a männlich A(p) p AA p Aa p A a(q) p aa p aa p a aa Aa Summe p A p a 1.0

13 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Die beiden Formeln für das Hardy-Weinberg Gleichgewicht lauten: p 2 + 2pq + q 2 = 1 p + q = 1 weiblich A(p) a(q) Summe männlich A(p) p AA p Aa p A a(q) p aa p aa p a Summe p A p a 1.0

14 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Die beiden Formeln für das Hardy-Weinberg Gleichgewicht lauten: p 2 + 2pq + q 2 = 1 p + q = 1 Allelfrequenzen Die Allelfrequenz eines Genpools ist in einer Idealpopulation konstant. Die relativen Häufigkeiten der betrachteten Allele sind zueinander komplementär. p + q = 1 p: relative Häufigkeit des Auftretens des Allels A q: Allelfrequenz des (zu A komplementären) Allels a weiblich Summe A(p) a(q) männlich A(p) p AA p Aa p A a(q) p aa p aa p a Summe p A p a 1.0

15 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Die beiden Formeln für das Hardy-Weinberg Gleichgewicht lauten: p 2 + 2pq + q 2 = 1 p + q = 1 Genotypfrequenzen Die Genotypenfrequenz eines Genpools ist in einer Idealpopulation konstant. p2 + 2pq + q2 = 1 p2 = h(aa) 2pq = h(aa) q2 = h(aa) weiblich Summe A(p) a(q) männlich A(p) p AA p Aa p A a(q) p aa p aa p a Summe p A p a 1.0

16 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Beispiel Mucoviszidose Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Die Mukoviszidose (Phänotyp a) ist autosomal-rezessiv (Erkrankung nur bei Genotyp aa) und betrifft in Deutschland eins von Kindern. Die Häufigkeit des Genotyps aa beträgt daher F(aa)= 1:2.500 = 0,0004. Berechnung von q: q 2 = F(aa) = 0,0004 <=> Wurzel aus q 2 = q = 0,02 (d.h. 2 % der Allele in der Bevölkerung sind defekt) Berechnung von p: p = 1 - q = 1-0,02 = 0,98 (d.h. 98 % der Allele sind gesund) Berechnung der Heterozygotenfequenz: F(aA) = 2 qp = 2 x 0,02 x 0,98 = 0,0392 (d.h. ca. 4 % der Bevölkerung sind gesunde Träger des defekten Gens). Häufigkeit homozygot Gesunder F(AA): F(AA) = p 2 = 0,98 2 = 0, /08/11 16

17 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps A a AB ab X B b Ab ab Segregation der SNPs entsprechend der Allelfrequenzen = Linkage equilibrium

18 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps A a AB ab Locus B Summe X B b B b Locus A A p AB p Ab p A a p ab p ab p a Ab ab Summe p B p b 1.0 p = Allelfrequenzen

19 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps Im Gleichgewicht p AB = p A p B p Ab = p A p b = p A (1 p B ) p ab = p a p B = (1 p A )p B p ab = p a p b = (1 p A ) (1 p B ) Locus B Summe B b Locus A A p AB p Ab p A a p ab p ab p a Summe p B p b 1.0 p = Reative Häufigkeit des entsprechenden Allels p A + p a = 1 p B + p b = 1

20 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps Im Ungleichgewicht p AB p A p B p Ab p A p b = p A (1 p B ) p ab p a p B = (1 p A )p B p ab p a p b = (1 p A ) (1 p B ) Locus B Summe B b Locus A A p AB p Ab p A a p ab p ab p a Summe p B p b 1.0 p = Reative Häufigkeit des entsprechenden Allels p A + p b = 1 p B + p b = 1

21 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps A a A a Segregation der SNPs entsprechend nicht der Allelfrequenzen = Linkage disequilibrium B b B b

22 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps Unter Linkage disequilibrium (LD) versteht man die nicht zufällige Assoziation von Allelen (SNPs). A a a A Rekombinante Haplotypen B b B b

23 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps p AB = p A p B Der Disequilibriums-Coeffizent D AB p Ab = p A p b = p A (1 p B ) p ab = p a p B = (1 p A )p B p ab = p a p b = (1 p A ) (1 p B ) D AB = p AB p A p B p AB = p A p B + D AB p Ab = p A p b D AB p ab = p a p B D AB Locus B Summe B b Locus A A p AB p Ab p A a p ab p ab p a Summe p B p b 1.0 p ab = p a p b + D AB p = Allelfrequenzen

24 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps Stabilität des Disequilibriums über Generationen

25 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps Unter Linkage disequilibrium (LD) versteht man die nicht zufällige Assoziation von Allelen (SNPs). ursprüngliche Genregion Heutige Genregionen Kombinationen gekoppelter Allelmarker beschreiben anzestrale Haplotypen

26 Linkage Disequilibrium und Haplotype-Maps Eine Kombination sorgfältig ausgewählter SNPs kann einen ganzen Genombereich eindeutig charakterisierten. Haplo 1 Haplo 2 Haplo 3 Haplo 4 Haplo 5 T T T T T T T T T T T T T T T 30 % 20 % 20 % 20 % 10 %