Magnesium-ProtoporphyrinIX-Chelatase: Ein Schlüsselenzym in der Tetrapyrrolbiosynthese

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1 Magnesium-ProtoporphyrinIX-Chelatase: Ein Schlüsselenzym in der Tetrapyrrolbiosynthese Vom Fachbereich Biologie der Universität Hannover zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften Dr. rer. nat. genehmigte Dissertation von Dipl.-Biol. Jutta Papenbrock geboren am in Hannover 1997

2 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Der Tetrapyrrolbiosyntheseweg 1.2 Isolierung pflanzlicher Tetrapyrrolbiosynthesegene 1.3 Magnesium-Protoporphyrin IX-Chelatase 1.4 Regulation der Tetrapyrrolbiosvnthese l.s Einfluß von verschiedenen Lichtqualitäten auf die Tetrapyrrolbiosynthese 1.6 Diurnale und circadiane Rhythmen in der Tetrapyrrolbiosynthese 1.7 Überlegungen zum Substratfluß in der Tetrapyrrolbiosynthese unter besonderer Berücksichtigung der MgCh 1.8 Chloroplastenenrwicklune und Aufbau der Photosysteme 1.9 Transgene Pflanzen 1.10 Zielsetzung der Arbeit > MATERIAL 2.1 Geräte i 2.2 Chemikalien, Enzyme, Reagenziensvsteme 2.3 Synthetische Oligonukleotide 2.4 Vektoren 2.5 Organismen 2.6 Antikörper 2.7 Medien METHODEN 3.1 Anzucht von Pflanzen Standardbedingungen Spezielle Versuchsbedingungen 3.2 Molekularbiologische Methoden PCR-Amplifizierung Klonierungen

3 3.2.3 Isolierung von cdna-klonen aus einer Tabak-cDNA-Bibliothek DNA-Sequenzierungen und deren Bearbeitung Sonden für die Hybridisierung Das Zweihybrid-System 3.3 Transformationen Bakterientransformation Pflanzentransformation 3.4 DNA-Analyse ("Southern-Blot") 3.5 RNA-Analyse ("Northern-Blot") 3.6 Analyse von Proteinen Proteinbestimmung SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese_ "Western-Blot" Antikörpergewinnung 3.7 Bestimmung von Enzymaktivitäten Aminolävulinsäure-Dehydratase-Aktivität Uroporphyrinogen III-Decarboxylase-Aktivität Coproporphyrin III-Oxidase-Aktivität Magnesium-Protoporphyrin IX-Chelatase-Aktivität_ Ferrochelatase-Aktivität Mg-Proto IX-Methyltransferase-Aktivität_ 3.8 Analyse von Tetrapyrrolen, Tetrapyrrolvorstufen und Carotinoiden Bestimmung der 5-Aminolävulinsäure-Synthesekapazität Bestimmung der Porphobilinogengehalte Bestimmung der Porphyringehalte Bestimmung der Chlorophyllgehalte und -syntheserate Bestimmung der Hämgehalte Bestimmung der Carotinoidgehalte 3.9 Weitere Methoden _30 31 _32 _33 34 _35 _35 J5 J6 _37 _38 _38 _39 J9 _39 _40 _ _42 _43 _ ERGEBNISSE 4.1 Isolierung und Sequenzierung der Chl D-cDNA von N. tabacum 4.2 Test auf Interaktionen der MgCh-Untereinheiten mit Hilfe des Zweihybrid-Systems 4.3 Rekonstitution der MgCh-Aktivität aus den drei in Hefe exprimierten Untereinheiten 46 _

4 4.4 Charakterisierung der MgCh in Tabakpflanzen Bemerkungen zur Durchführung der Experimente Charakterisierung während der Entwicklung Charakterisierung während der Ergrünung Charakterisierung während eines Tagesganges sowie unter konstanten Bedingungen Charakterisierung am Beginn einer Illuminationsperiode Transgene Pflanzen mit veränderter MgCh- oder FeCh-Aktivität Beschreibung der Phänotypen Beschreibung der Chl 7-sense- und -antisense-pflanzen Beschreibung der Chl //-antisense-pflanzen Beschreibung der Chl //-sense-pflanzen Beschreibung der FeCh /-antisense-pflanzen Charakterisierung der Chl /-sense- und -antisense-pflanzen "Northern-Blot"-Analyse "Western-Blot"-Analyse : Bestimmung von Enzymaktivitäten Bestimmung von Zwischen- und»endprodukten des Tetrapyrrolsyntheseweges Bestimmung der ALA-Synthesekapazität Bestimmung von Carotinoidgehalten sowie LHC-Proteinmengen Bestimmung von Metallgehalten Charakterisierung der Chl //-antisense-pflanzen "Northern"- und "Western-Blot"-Analyse Bestimmung von Enzymaktivitäten Bestimmung von Zwischen- und Endprodukten Bestimmung von Chlorophyll- und Carotinoidgehalten sowie LHC-Proteinen _ Bestimmung von Metallgehalten Charakterisierung der Chl //-sense-pflanzen "Southern-Blof'-Analyse "Northern"- und "Western-Blof'-Analyse Bestimmung von Enzymaktivitäten Bestimmung von Zwischen- und Endprodukten der Tetrapyrrolbiosynthese Charakterisierung der FeCh /-antisense-pflanzen "Northern-Blof'-Analyse "Western-Blot"-Analyse Bestimmung von Enzymaktivitäten Bestimmung von Zwischen- und Endprodukten der Tetrapyrrolbiosynthese Bestimmung von Metallgehalten Anzucht von Pflanzen unter verschiedenen Lichtqualitäten 107

5 5 DISKUSSION CHL D, die dritte Untereinheit der pflanzlichen MgCh Möglichkeiten und Grenzen des Zweihybrid-Systems Die heterolog in Hefe exprimierten Proteine CHL D, H und I aus Tabak sind für die Rekonstitution von MgCh-Aktivität notwendig Die zentrale Rolle der MgCh in der Tetrapyrrolsynthese MgCh und andere Enzymschritte der Tetrapyrrolbiosynthese während der Entwicklung MgCh und andere Enzymschritte der Tetrapyrrolbiosynthese in verschiedenen Organen MgCh und andere Enzymschritte der Tetrapyrrolbiosynthese während der Ergrünung Bedeutung von Rhythmen für die MgCh und andere Enzymschritte der Tetrapyrrolbiosynthese Diurnale Rhythmen und der Einfluß von Licht Circadiane Rhythmen Transgene Pflanzen mit veränderten Chelataseaktivitäten FeCh /-antisense-pflanzen Transgene MgCh-Pflanzen Abschlußdiskussion ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS 139