Untersuchungen zum Einfluss von alpha Defensinen. aus neutrophilen Granulozyten auf die. primäre Hämostase

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1 Aus dem Institut für Veterinär-Physiologie der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. Joachim Roth und Der Abteilung für Experimentelle und Klinische Hämostaseologie, Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster Betreuerin: Prof. Dr. Beate Kehrel Untersuchungen zum Einfluss von alpha Defensinen aus neutrophilen Granulozyten auf die primäre Hämostase INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Meike Hörn Tierärztin aus Unna (Nordrhein-Westfalen) Gießen 2008

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Thrombozyten Thrombozytenmorphologie Hämostase Adhäsion Aktivierung und Sekretion Aggregation Sekundäre Hämostase Gegenregulation der Aktivierung Fibrinolyse Thrombozyten als Abwehrzellen Plättchen teilen strukturelle und funktionelle Merkmale mit bekannten Abwehrzellen Plättchen agieren direkt und indirekt mit Mikroorganismen Thrombozytäre antimikrobielle Peptide Thrombozyten und Leukozyten interagieren synergistisch Defensine Alpha Defensine Beta-Defensine 22

3 O-Defensine Defensin-Aktivität Zytolytischer Effekt Modulation der innaten und adaptiven Immunabwehr Pafhophysiologie Hintergrund und Fragestellung der wissenschaftlichen Arbeit Material und Methoden Geräte Durchflusszytometer ELISA-Reader Zentrifugen Weitere Geräte Chemikalien Antikörper : Präparation von Thrombozyten und Monozyten Isolierung von Thrombozyten durch Gewinnung von Plättchenreichem Plasma (PRP) Isolierung von Thrombozyten mittels Gelfiltration Herstellung von Plättchen-armen Plasma(PPP) Isolierung der Leukozyten Zellzählung 36

4 2.4. Zellaktivierung Defensin Thrombin Kollagen ADP C-terminales TSP-1-Peptid RFYVVMWK Detektion von Plättchenaktivierung Durchflußzytometrie Nachweis der Plättchenaktivierung Fibrinogenbindung a-granula-sekretion Sekretion der elektronendichten Granula (Dense-bodies), CD63- Expression Expression des CD40 Liganden Bindung von extern zugesetztem TSP Prokoagulanter Zustand Messung der Annexin V-Bindung an Thrombozyten Messung der Faktor Vlll-Bindung an Thrombozyten Messung der Faktor Xa-Bindung an Thrombozyten Messung von Thrombozytenmikropartikeln Detektion von Thrombozyten -Leukozyten-Assoziaten 52

5 Probenvorbereitung für Untersuchungen im Vollblut Einfluß verschiedener Modulatoren auf die Thromboytenaktivierung durch Defensin Antithrombin III Heparin Thrombospondin Hirudin a 2-Makroglobulin a 1-Antitrypsin Vitronectin ; lloprost und'pge Bacitracin ELISA-Verfahren scd 40 L ELISA Thrombinbildungsassay Endothelzellversuche Kultivierung von HMEC-1 (human microvascular endothelial cellline-1) Endothelzellaktivierung Membranpermeabilität von Endothelzellen Statistische Absicherung der experimentellen Daten 66

6 3. Ergebnisse Durchflußzytometrische Untersuchungen zum Einfluß von Defensin auf die Thrombozytenaktivierung Fibrinogenbindung an gelfiltrierte Plättchen induziert durch klassische Agonisten und alpha Defensine Fibrinogenbindung an gelfiltrierte Plättchen verschiedener Tierarten Fibrinogenbindung an Thrombozyten nach HNP Aktivierung im PRP Fibrinogenbindung an Thrombozyten nach beta-defensin Aktivierung bei gelfiltrierten Plättchen Zeitkinetik a-granula-sekretion Dense-bodies"-Sekretion Bindung des TSP-1 an die Plättchenoberfläche CD40 Ligand Expression der Thrombozyten Ausbildung des prokoagulanten Zustands Mikropartikelformation Untersuchungen zum Einfluß von HNP 1-3 im Citratantikoaguliertem Vollblut Einfluß verschiedener Proteine auf die HNP induzierten Plättchenaktivierung 83

7 Einfluß von ATill auf die HNP induzierte Thrombozytenaktivierung Einfluß von Hirudin auf die HNP induzierte Thrombozytenaktivierung Einfluß von alpha 2 Makroglobulin auf die HNP induzierte Thrombozytenaktivierung Einfluß von a1 Antitrypsin Einfluß von Adhäsionsproteinen Einfluß von Prostaglandinen Einfluß von Albumin Einfluß von Bacitracin Elisaverfahren Abgabe von löslichem CD40L ins Plasma nach Aktivierung von Thrombozyten mit HNP Einfluß von HNP auf die Thrombinbildung in Gegenwart von Thrombozyten Einfluß von HNP-1 auf Endothelzellen Effekt von C-terminalem TSP-1-Peptid RFYWMWK Einfluß von HNP-1 auf die Permeabilität der Thrombozytenmembran Diskussion HNP1-3 sind starke Plättchen- und Endothelzellagonisten Hemmung der Defensinwirkung 113

8 4.3. Spekulationen über den Wirkmechanismus der Plättchenaktivierung durch HNPs Ausblick Zusammenfassung Summary Abkürzungsverzeichnis Publikationen Veröffentlichte Abstracts Manuskripte in Bearbeitung Erklärung Literaturverzeichnis 137