Praktikumsteil: Zellkultur und Fluoreszenzmikroskopie

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Bella Lang
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1 (Version: ) Praktikumsteil: Zellkultur und Fluoreszenzmikroskopie Darstellung und Untersuchung von Zellorganellen und Zytoskelettkomponenten Einleitung Der Lokalisation von Proteinen kommt in der Zellbiologie und der klinischen Diagnostik eine bedeutende Rolle zu. Die Verwendung von Zellkulturen oder Geweben erfordert in der Regel eine Vorbehandlung bzw. Fixierung des Materials, die sowohl die Zellstrukturen als auch die antigenen Eigenschaften der Proteine bestmöglich erhalten soll. Für die Lokalisation von Proteinen werden häufig mono und polyklonale Antikörper eingesetzt, deren Lokalisation sich durch die Kopplung an einen Fluoreszenzfarbstoff sichtbar machen läßt. Hierbei kann das Fluorochrom (in der Regel Fluorescein oder Rhodaminderivate) direkt an den Primärantikörper (direkte Immunfluoreszenz) oder aber an einen Sekundärantikörper (indirekte Immunfluoreszenz) gekoppelt sein. Will man Fixationsartefakte ausschließen, müssen Zellen im lebenden Zustand beobachtet werden. Durch die Entwicklung neuer Lebendfarbstoffe, die Kombination von Video und Computertechnik mit der Lichtmikroskopie, und durch die gentechnische Nutzbarmachung von GFP kommt der in vivo Mikroskopie bei der Analyse von zellbiologischen Prozessen eine immer größere Bedeutung zu. Aufgabenstellung In diesem Praktikumsteil sollen unterschiedliche Zellkompartimente und Zytoskelettkomponenten in fixierten Zellen markiert und mikroskopisch analysiert werden. Teil 1 umfasst die Kultivierung und experimentelle Vorbereitung der Zellen; Teil 2 die Herstellung der Fluoreszenzpräparate und Teil 3 die Auswertung der Fluoreszenzpräparate. Hierbei sollen unterschiedlich lokalisierte Proteine, verschiedene Fixierungs und Markierungsmethoden sowie unterschiedliche Fluoreszenzmarker verwendet und verglichen werden.

2 Teil 1: Zellkultur (1. Tag) Einführung Zur biochemischen und morphologischen Analyse einer relativ homogenen Population von Säugerzellen wurden Methoden zur Kultivierung und Proliferation einzelner Zelltypen (Zellinien) entwickelt. Die grundlegenden Methoden der Zellkulturtechnik sollen besprochen und vermittelt werden. Die Vorbereitung der Zellen für die nachfolgenden Versuche soll erfolgen. Einführung in die Zellkulturtechnik Permanente Zellinien, Primärkulturen Adhärente Zellen, Suspensionskulturen Zellkulturmedien und Seren, serumfreie Kultur Steriles Arbeiten, Antibiotika, Kontaminationen Inkubation Medienwechsel Passagieren der Zellen Auftauen/Einfrieren von Zellstocks Versuchsdurchführung: Zellen Reagenzien Material HeLa Zellen (Cervix Carcinoma) PBS (phosphate buffered saline), ph 7,3, 1x konz., steril DMEM (low glucose), 10% FCS, Antibiotika, L Glutamin Trypsin/EDTA Lösung 70% Ethanol zum Desinfizieren Gewebekulturschalen Uhrmacherpinzetten Deckgläschen, steril Pasteurpipetten, Glas und Plastikpipetten, steril Sterile Werkbank mit Absaugeinrichtung Inkubator (37 C, 5% CO2)

3 ACHTUNG bei allen folgenden Arbeitsschritten darauf achten, dass die Zellen nicht kontaminiert werden! Steril arbeiten!!! 1. Kulturmedium einer 10 cm 2 Schale mit einer Pasteurpipette absaugen 2. Zellen 1x mit 5 ml PBS waschen 3. 1 ml Trypsin/EDTA zugeben, kurz (max. ca. 5 min) bei RT inkubieren (mikroskopische Kontrolle) 4. abgelöste Zellen in Medium aufnehmen, in 15 ml Falconröhrchen sammeln 5. Zentrifugation: 500g, 5 Min., RT 6. währenddessen sterile Deckgläschen in Gewebekulturschalen legen, Medium zugeben 7. Medium im Falconröhrchen (Überstand) absaugen, Zellpellet in frischem Medium 8. Die Zellen vorsichtig aber gründlich resuspendieren (8 10 ml) 9. Zellzahlbestimmung 10. Aussaat von ca Zellen in die vorbereiteten Gewebekulturschalen 11. Inkubation bei 37 C, 5% CO2

4 Teil 2: Fluoreszenzmarkierung von Zellorganellen in situ (2. Tag) Einführung Durch direkte und indirekte Fluoreszenzmarkierung sollen Isoformen der humanen Thioredoxine und Glutaredoxine (Proteine der Redoxhomöostase), Zellorganellen und Cytoskelett komponenten in verschiedenen Zellinien dargestellt werden. Es sollen jeweils Mehrfach Markierungen mit unterschiedlich manipulierten, fixierten und permeabilisierten Zellen durchgeführt werden. Dabei werden unterschiedliche Fluoreszenzmarker verwendet. Zusätzlich werden in Kontrollversuchen die spezifischen primären Antikörper vor der Inkubation mit den Proben mit Antigen gesättigt um die Spezifität der Färbung zu untersuchen. Versuchsdurchführung Reagenzien Waschpuffer: PBS (phosphate buffered saline), ph 7,3, 1x konz. Fixans: p Formaldehyd, 4% in CMF PBS, RT, Methanol, abs., 20 C Block und Permeabilisationspuffer: 10 mm HEPES, 3% BSA, 0,3 % Triton X 100 in PBS Einbettmedium: Mowiol 4.88 in Glycerin spezifische Primärantikörper Fluorochrom markierte (AlexaFlour 488) Sekundärantikörper Hoechst Farbstoff (DNA Färbung) Mitotracker DeepRed 633 Material Filterpapier Plastikpetrischalen als feuchte Kammern Uhrmacherpinzetten Objektträger Absaugpumpe

5 ACHTUNG bei allen folgenden Arbeitsschritten darauf achten, dass die Zellen nicht austrocknen!!! I. Mitochondrienfärbung (Dieser erste Teil wird von den Betreuern vor der Fixierung durchgeführt) 1. Kulturmedium mit einer Plastik Pasteurpipette absaugen 2. Zellen 2x mit PBS (1x konz., ca. 10 ml/schale) waschen 3. Auftropfen der Mitotracker Verdünnung II. Fixierung 4. Zellen 3x mit PBS waschen 5. p Formaldehydlösung zupipettieren (1 2ml/Schale), 20 min bei Raumtemperatur fixieren, mit PBS waschen 6. Zellen mit Block und Permeabilisierungspuffer permeabilisieren (1 2 ml /Schale) für 60 min 7. 3x mit PBS waschen III. Blocken 8. Antikörperverdünnungen fertigstellen 1. Antikörperverdünnungen OHNE Antigen im Eis aufbewahren 2. Antikörperverdünnung MIT 30 µg/ml Antigen bei RT inkubieren 9. Feuchte Kammer herstellen: In eine Plastikpetrischale passendes Stück Filterpapier in den Deckel legen, befeuchten (nicht ertränken!) 10. PBS absaugen IV. Primärantikörper 11. Die Primärantikörpers in einem Tropfen auf das Deckglas pipettieren, Deckel der Feuchtekammer mit feuchtem Filter auflegen, bei RT min inkubieren 12.3x mit PBS waschen μ l des Sekundärantikörpers auf das Deckglas auftropfen, Deckel mit feuchtem Filter auflegen, bei RT min lichtgeschützt inkubieren 14. 3x mit PBS waschen V. Kernfärbung 15. Hoechst Verdünnung auftropfen und 5min im Dunkeln inkubieren 16. 3x mit PBS waschen VII. Eindeckeln der Präparate 17. Objektträger vorbereiten: Für jedes Deckglas einen Objekttäger putzen, beschriften und mit einem kleinen Tropfen Mowiol versehen 18. Jedes Deckgläschen mit Pinzette aus PBS nehmen, kurz in Becherglas mit dest. Wasser tauchen, überschüssige Flüssigkeit am Rand mit Flterpapier absaugen 19. Deckgläschen umgekehrt (Zellen nach unten!!!) und möglichst luftblasenfrei auf Mowioltropfen auflegen und leicht andrücken 20. Präparate über Nacht trocknen, danach lichtgeschützt und kühl lagern

6 Teil 3: Fluoreszenzmikroskopie (3. Tag) Am dritten Tag werden die Präparate am Fluoreszenzmikroskop (Olympus oder Leica) ausgewertet und dokumentiert. Die Beobachtungen und Ergebnisse der Auswertung sollen in einem kurzen Ergebnisprotokoll zusammengefaßt werden.

7 Uhrzeit Zeitplan für die Zellkulturarbeit am Dienstag (Gruppennummern) Gruppen Zeitplan für die Fluoreszenzmikroskopie am Donnerstag (Gruppennummern) Uhrzeit Fluoreszenzmikroskop Konfokales Mikroskop

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