KERNMODUL 3 ZELL- UND ENTWICKLUNGSBIOLOGISCHER KURS VL:

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1 KERNMODUL 3 ZELL- UND ENTWICKLUNGSBIOLOGISCHER KURS VL: SS2008 TEILSKRIPT: ENTWICKLUNGSBIOLOGIE BUTTGEREIT, DETLEV; RENKAWITZ-POHL, RENATE 1

2 VERSUCH 1: PRÄPARATION VON FURCHUNGSSTADIEN VON PANAGRELLUS REDIVIVUS (NEMATODEN) Bei Panagrellus redivivus handelt es sich um einen kleinen, im Boden freilebenden, nicht-pathogenen Nematoden, der eng mit C. elegans verwandt ist. Es gibt zwei Geschlechter: selbst-befruchtende Hermaphroditen (XX) sowie seltener Männchen (XO). P. redivivus durchläuft 5 Entwicklungsstadien: J1: innerhalb der Eihülle J2: 0,25 0,35 mm J3: 0,35 0,55 mm J4: 0,55 0,75 mm Die adulten Nematoden haben eine Länge von. ca. 2 mm Länge. Abb. 1: Panagrellus redivivus Weibchen (XX) Schema 1: Genereller Lebenszyklus eines Nematoden (aus Wolpert: Principles of Development; 2nd edition) 2

3 Die ersten Entwicklungsstadien der befruchteten Eier und die Furchungsstadien lassen sich anhand einer sehr einfachen Präparationstechnik leicht beobachten. Praktische Durchführung Hierzu werden die adulten Nematoden zunächst immobilisiert, da dies die Präparation erleichtert. Die Panagrelli finden sie in einem mit P beschrifteten Eppendorf-Reaktionsgefäß, dieses müssen sie für maximal 1 min auf 65 o C erwärmen (Thermoblock, steht zentral aus!). Anschließend transferieren sie die Nematoden auf einen Objektträger (Wichtig: Unbedingt alle Nematoden aufwirbeln und transferieren, da die adulten Tiere infolge ihrer Größe und höheren Dichte auf den Grund des Reaktionsgefäßes sinken!!), zerhacken sie mit einer Skalpellklinge mehrfach, legen ein Deckglas (20x32 mm) auf und betrachten die Präparate unter Phasenkontrastoptik. Dabei ist wichtig, dass Sie ausreichende Mengen an PBS auf Ihrem Objekträger haben, damit die Nematoden auf keinen Fall austrocknen; nach dem Auflegen des Deckglases müssen Sie allerdings überschüssige Flüssigkeit vorsichtig (mittels eines Stückchens Haushaltsrolle; Kappilarsog) entfernen. Aufgabe Zeichnen Sie drei verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung, die Sie in Ihrem Präparat beobachten können, sowie einen adulten Hermaphroditen. Abb 2: Prinzipieller Aufbau eines Nematoden (aus Wolpert: Principles of Development; 2nd edition) 3

4 VERSUCH 2: IDENTIFIZIERUNG UND DARSTELLUNG FRÜHER FURCHUNGSSTADIEN VON DROSOPHILA MELANOGASTER Theorie Um die frühen Stadien der Drosophila Embryoentwicklung beobachten zu können ist es nötig die DNA mittels eines Farbstoffs sichtbar zu machen. Hierzu wurden Drosophila Embryonen mittels basischem Fuchsin gefärbt (visualisiert die DNA), entwässert und in EPON (Kunstharz für Dauerpräparate) eingebettet. Aufgabe Betrachten Sie die Ihnen ausgegebenen Präparate unter Hellfeldoptik, versuchen Sie einzelne Stadien anhand des Schemas zu identifizieren und zeichnen Sie skizzenhaft mindestens 4 repräsentative, aufeinander folgende Stadien wie Sie sie im Mikroskop beobachten können. Schema 2: Furchungsstadien des Drosophila Embryos Zahl oben links: Minuten nach Ei-Ablage; Zahl unten links: Anzahl der Kerne. 4

5 VERSUCH 3: ANFERTIGUNG VON KUTIKULA-PRÄPARATEN VON DROSOPHILA MELANOGASTER Theorie und Einleitung Die Anzahl und Identität von Segmenten in Drosophila melanogaster läßt sich anhand der Struktur der Kutikula leicht demonstrieren. Fehlen Segmente, oder ist deren Identität verändert, zeigt sich dies leicht am Aussehen (kleiner als normal, verkrüppelt oder an Änderungen in der Anzahl bzw. der Struktur der Zähnchenreihen). Im Praktikum sollen verschiedene Mutanten analysiert und interpretiert werden. Abb. 5: Schematische Darstellung der larvalen Kutikula von Drosophila melanogaster Dorsal Anterior Anterior AP = Analplatte; PS = posterior spiracles 5

6 Schema 3: Beispiele von Entwicklungsmutanten sowie Kutikula-Phänotypen 6

7 Praktische Durchführung A) Entfernen des Chorions 1. Die Eier werden von den Ablageplatten mit Hilfe von 0,7% NaCl/Triton X- 100 (=TNX) und eines Pinsels abgesammelt und in Netzchen überführt. 2. Eier mehrfach mit TNX waschen. 3. Eier in einer 1:1 Verdünnung von Klorix/TNX dechorionisieren; dabei Netzchen leicht bewegen, Grad der Chorionauflösung unter dem Binokular verfolgen. 4. Eier mit TNX gründlich waschen. B) Fixieren und Eindecken 1. Die Embryonen werden mittels eines Pinsels möglichst vorsichtig auf einen Objektträger transferiert, auf dem 1 Tropfen Hoyers/Milchsäure vorgelegt wurde. Ein Deckgläschen 24x32 mm vorsichtig und luftblasenfrei auflegen und die Präparate für 1 h bei 60 o C zur Klärung inkubieren. Auswertung Zur Auswertung betrachten Sie Ihre Präparate unter Phasenkontrastoptik bzw. Dunkelfeldoptik und versuchen Sie, den Phänotyp einer der beschriebenen Mutanten-Klassen zuzuordnen. Zeichnen Sie eine Wildtyp-Larve sowie je eine repräsentative mutante Larve. Kreuzen Sie auf dem Protokoll-Blatt die von Ihnen identifizierte Mutante-Klasse an. 7