Fachmodul. "Methoden in Entwicklung, Biologie der Zelle und deren Parasiten"

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1 KU Fachmodul "Methoden in Entwicklung, Biologie der Zelle und deren Parasiten" SS 2008 Kursskript Entwicklungsbiologie 4.0 SWS 6 ECTS-Punkte Philipps-Universität Marburg FB Biologie 1

2 Einführende Bemerkungen Die praktischen Arbeiten werden in Gruppen zu 3 Personen durchgeführt. Sie haben zu jedem Kurstag/Kursteil/Experiment ein Protokoll pro Gruppe anzufertigen. Dieses beinhaltet die Theorie zum Versuch, unterteilt, wo nötig, in Theorie zum biologischen System/Organismus plus Theorie zum Versuch, Durchführung, Ergebnis, Auswertung und Diskussion. Auswertung bedeutet dass z.b. Embryonen auf Bildern korrekt orientiert dargestellt werden, d.h. anterior nach links und ventral nach unten, und relevante Muster oder Gewebe mit Pfeilen markiert und in der Abbildungslegende erläutert sind. Das Protokoll sollte am Computer angefertigt werden, oder aber alternativ mit gut leserlicher Handschrift. Der Umfang ist dem Versuch angemessen zu wählen. 2

3 Skript zu Teil 3: Entwicklungsbiologie am Modellorganismus Drosophila melanogaster Leitung: Prof. Renate Renkawitz-Pohl, Dr. Detlev Buttgereit 1) Ermittlung mutanter Phänotypen im Drosophila Embryo mittels spezifischer Antikörper 2) Konsequenzen und Analyse gezielter Fehlexpression von Genen in Drosophila: Das UAS-Gal4-System 3

4 Einführung Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein beliebtes und häufig benutztes Objekt der klassischen Genetik und Entwicklungsbiologie, weil sie leicht in großen Mengen im Labor zu ziehen ist und eine relativ kurze Generationszeit von 8 Tagen (bei 29 C) bis 18 Tagen (bei 18 C) aufweist. Fliegen sind holometabole Organismen, d.h. sie durchlaufen zwischen Larvenstadium und adultem Insekt eine Metamorphose. Abbildung 1: Lebenszyklus von Drosophila melanogaster Die Entwicklung vom abgelegten Ei bis zur 1ten Larve geschieht innerhalb von 24 Stunden, und dieser Zeitraum ist für die Entwicklungsbiologie von Interesse und daher auch Thema dieses Kursteils. Die Embryoentwicklung wird in eine Reihe von morphologisch gut erkennbaren Stadien eingeteilt (siehe Abbildung 2). 4

5 Abbildung 2: Embryonalstadien von Drosophila melanogaster (aus Hartenstein, Atlas der Drosophila-Entwicklung) 5

6 Abbildung 3: Embryonalentwicklung von Drosophila melanogaster - tabellarisch 6

7 Die Antikörperfärbung nach der ABC-Methode (Avidin- Biotinylated-Enzyme Complex) Die weite Verbreitung immunhistochemischer Methoden in den letzten Jahren wurde begleitet von der Entwicklung einer Vielzahl von Techniken, die auf verschiedenen Ansätzen beruhen und eine hohe Spezifität und Sensibilität sicherstellen sollen. Besondere Verbreitung haben Techniken gefunden, die auf der Interaktion von Avidin und Biotin, also auf dem Gebrauch biotinylierter Antikörper beruhen. Alle Avidin-Biotin Methoden basieren auf vier Grundprinzipien: 1. Der außerordentlich hohen Affinität zwischen Avidin und Biotin Molekülen, 2. Der Möglichkeit, Biotin durch eine einfache biochemische Reaktion an größere Moleküle wie Enzyme oder Antikörper zu koppeln, ohne deren Eigenschaften zu verändern. 3. Der Möglichkeit Avidin mit einer Vielzahl von Markern zu versehen, wie z.b. Enzymen, Schwermetallen oder Fluoreszenzfarbstoffen. 4. Der Fähigkeit des Avidins, als Brücke zwischen zwei verschiedenen biotinylierten Molekülen, etwa einem Antikörper und einer Peroxidase, zu dienen. Warner und Levy hoben 1980 die besondere Eignung des Avidin-Biotin Systems für immunhistochemische Nachweise unter Verwendung z.b. monoklonaler Antikörper hervor. Hsu et al. (1981) beschrieben eine interessante Entwicklung dieser Technik, die Avidin-Biotin- Komplex-Methode (ABC), deren Vorteil eine außerordentlich hohe Sensitivität ist und mit der die Anwendung von Avidin und Biotin in immunbiologischen Untersuchungen weite Verbreitung und Popularität gewann. Chemische Grundlagen Avidin: Avidin ist ein basisches Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von rund Es wird aus Hühnereiweiß isoliert und besteht aus vier Polypeptid-Untereinheiten von je 128 Aminosäuren. Eine Charakteristik der Tertiärstruktur des Avidin-Moleküls ist die Anwesenheit von vier hydrophoben Taschen (eine für jede Untergruppe) an der Oberfläche, welche als spezifische Biotin-Bindungsstellen dienen. Biotin: Biotin ist ein wasserlösliches Vitamin (Vitamin H) mit einem Molekulargewicht von 244,31. Es ist als Wachstumsfaktor in sehr geringen Mengen in jeder Zelle vorhanden und liegt meistens gebunden an Proteine oder Polypeptide vor. Biotin wurde zuerst 1936 aus Eigelb isoliert; eine relativ hohe Biotinkonzentration findet man auch in Hefezellen, Milch sowie Leber-, Nieren- und Tumorgeweben (Moss et al., 1971). Biotin bindet mit einer Affinität von mehr als M -1 an Avidin und wird dadurch inaktiviert (Liu et al., 1979). Diese nicht kovalente Bindung verläuft sehr schnell und wird als eine der stärksten natürlichen Bindungen betrachtet. Die meisten Antigen-Antikörper-Bindungen haben dagegen nur eine Affinitätskonstante von 10 9 M -1. DAB: 3,3 -Diaminobenzidin 4 HCl (auch 3,3, 4,4 -Tetraaminobiphenyl, carcinogen! R11) DAB hat ein Molekulargewicht von 396,2 und formt farblose bis rosafarbige, nadelförmige Kristalle. Es ist schwer löslich in organischen Lösungsmitteln, aber bildet in Wasser eine weiße, zersetzliche Lösung. 7

8 HRP: horse-radish-peroxidase, Meerettichperoxidase Das Enzym HRP ist ein Pflanzenglykoprotein mit einer kovalent gebundenen, eisenhaltigen Hämgruppe als Koenzym. Es hat ein Molekulargewicht von ca In einem passenden Medium verbindet sich HRP leicht mit seinem Substrat H 2 O 2. Der resultierende [HRP.H 2 O 2 ] Komplex kann eine Vielzahl chromogener ( zu einem Farbumschlag fähiger ) Stoffe oxidieren ((CHR)H 2 ). Diese nehmen im oxydierten Zustand eine dunkle Färbung an und wirken als leicht erkennbare Marker für HRP- Aktivität. An Stellen, die HRP-Aktivität enthalten, laufen zwei Reaktionen ab: HRP + H 2 O 2 =======> [HRP.H 2 O 2 ] [HRP.H 2 O 2 ] + (CHR)H 2 =======> (CHR) + HRP + 2H 2 O Die Kombination von HRP mit H2O2 verläuft schnell und hochspezifisch und es gibt praktisch keine Rückreaktion. Da der nicht katalysierte Zerfall von H2O2 in H2O sehr viel Energie benötigt, findet keine Oxidation des Chromogens ohne Einwirkung von HRP statt. Im folgenden ist der hypothetische Reaktionsmechanismus von DAB mit Peroxidase und H 2 O 2 dargestellt. Das entstehende, unlösliche Indaminpolymer verursacht Braunfärbung. Biotinylierung: Als Biotinylierung bezeichnet man das chemische Verfahren, durch das Biotin an eine Vielzahl von Makromolekülen wie Antikörper, Enzyme und Nukleinsäuren gebunden wird. Die geringe Größe des Biotins verhindert, dass dabei die chemischen, immunologischen oder physikalischen Eigenschaften jener Moleküle verändert werden. Darüber hinaus ist sogar eine vielfache Biotinylierung eines Moleküls möglich. Um die Gefahr einer sterischen Behinderung bei der späteren Bindung des biotinylierten Moleküls an Avidin zu verringern, wird bei Beladung des Makromoleküls an Biotin ein sogenannter spacer arm eingeführt. Dieses 7 bis 16 Atome lange Molekül dient als Brücke zwischen Biotin und dem Makromolekül. Dies erhöht die Anzahl der möglichen Avidin-Bindungen und damit die Sensitivität der Methode. Markierung des Avidins: Avidin kann mit verschiedenen Markern verknüpft werden z.b. Fluoreszenzfarbstoffen wie Rhodamin oder Fluorescein, Enzymen wie Phosphatase, Peroxidase oder ß -Galaktosidase, Schwermetallen wie Gold oder Silber. Bei Anwendung der ABC,-Methode ist nur eine Markierung mit Enzymen möglich 8

9 Die indirekte ABC-Methode Zunächst wird ein primärer Antikörper verwendet, der eines oder mehrere Epitope des zu detektierenden Proteins erkennt und spezifisch daran bindet. Dieser wird dann wiederum durch einen zweiten Antikörper detektiert, der gegen IgG s der Spezies gerichtet ist, in der der primäre Antikörper hergestellt wurde (z.b. Primär-Antikörper aus Kaninchen, Sekundär- Antikörper aus Ziege, die mit Kaninchen IgG immunsiert wurde = -Kaninchen, hergestellt in Ziege). Der Zweit-Antikörper ist mit Biotin markiert, und kann somit mit Avidin interagieren. Avidin verbindet sich zudem mit der biotinylierten Meerettichperoxidase zu einem Komplex, bei dem jedoch einige Biotin-Bindungsstellen am Avidin frei bleiben. Mit diesen lagert sich der bis zu mehreren Stunden stabile Komplex an den biotinylierten Sekundärantikörper. Es findet also eine Verstärkung der Enzymreaktion statt biotinylierter Sekundär-AK Primär-AK Literaturhinweise: Coggi G, DellÓrto P, Viale G (1986): Avidin-Biotin Methods. In: Polack JM, Van Norden S, ed.: Immunocytochemistry, Hsu SM, Raine L, Fanger H (1981): Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J. Histochem. Cytochem. 29, Warnke R, Levy R (1980): Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies: an avidin-biotinhorseredish peroxidase method. J. Histochem. Cytochem. 28,

10 Teil 1: Immunfärbungen an Drosophila Embryonen ERSTER TAG Dechorionisieren und Fixieren Dechorionisieren Die Embryonen werden mit 0.7% NaCl/0.05% Triton X-100 (=TNX) mit einem Pinsel von den Schalen abgesammelt (unter dem Bino kontrollieren, vorsichtig absammeln um die Embryonen nicht zu beschädigen!!) und in ein geeignetes Netzchen (Eppendorfreaktionsgefäß, ungefähr im oberen Drittel abgeschnitten und ein passendes Stück dünnen Maschendrahtes angeschmolzen) überführt. Zum Dechorionisieren werden sie mit einer 1:1 Mischung von Klorix/TNX behandelt; dauert ca. 1 bis 1 1/2 Minuten, Netzchen dabei bewegen; der Fortschritt muss unbedingt unter der Stereolupe kontrolliert werden (Embryos werden glänzend, beginnen aneinander zu kleben). Anschließend mit reichlich TNX zum Stoppen des Vorgangs waschen. Fixieren und Devitellinieren Die Embryonen werden in ein Eppendorfgefäß transferiert, je 500 l Heptan sowie 500 l 4% Formaldehyd/PBT ph 7.0 zugegeben und das Cup auf einem Laborschüttler befestigt. 10 min heftig schütteln (beide Phasen müssen gut durchmischt sein, um die an den Phasengrenzen ablaufende Reaktion zu ermöglichen), kurz stehen lassen, dann Überstand vorsichtig abziehen (Embryonen sinken dabei zunächst nicht nach unten, sondern ordnen sich in einer Art von Blasen an der Phasengrenze Heptan/PBS an). Es wird dann 3 mal mit je 500 l Heptan gewaschen, wobei das Heptan am besten langsam immer wieder durch die wässrige Phase perlen gelassen wird, um die Embryonen mehr oder weniger komplett an der Interphase zu versammeln. Dies ist nötig, da zum anschließenden Devitellinieren die wässrige Phase soweit wie möglich entfernt sein muß, d.h. Überstand möglichst weitgehend entfernen. Zum Entfernen der Vitellin-Membran werden jetzt 500 l Heptan sowie 500 l Methanol zugegeben, 1 min geschüttelt (auch hier gründliche Durchmischung notwendig), Embryonen absinken lassen, Überstand abziehen, 3 mal mit je 1 ml MeOH waschen. Die Embryonen müssen jetzt zum Denaturieren ca. 30 min stehen gelassen werden, dabei nach 15 min das MeOH einmal wechseln. 10

11 Antikörperinkubation MeOH abziehen, 1 ml PBT zugeben, Embryonen absinken lassen, PBT abnehmen, erneut 1 ml frisches PBT zugeben, dann 30 min waschen (langsam auf einem Schüttler, die Embryonen sollen gerade mal so bewegt werden. PBT abziehen, Zugabe des ersten Antikörpers (Art und Verdünnung nach Angabe). Inkubation über Nacht bei 4 o C unter permanentem Bewegen. ZWEITER TAG Den Erst-Antikörper abnehmen und verwerfen. Die Embryonen mit je 1 ml PBT waschen (1 mal kurz, 1 mal 20 min). Anschließend erfolgt das Blocken: Die Embryonen werden in diesem Schritt zur Abschwächung unspezifischer Bindungen mit dem Serum inkubiert, das aus dem Tier stammt, in dem der Zweit-Antikörper hergestellt wurde. In unserem Falle ist dies Ziegenserum (Normal Goat Serum). Pro Reaktionsgefäß/Färbung werden 500 l 2% Ziegenserum in PBT = PBT/ZS) verwendet und die Embryonen für 20 min inkubiert (Schüttler, leicht bewegen) Parallel dazu d.h. gleichzeitig muss der Zweitantikörper an ebenfalls fixierten Embryonen (sog. DUMMIES) zur Absättigung unspezifischer Bindungsaktivitäten vorinkubiert werden. Dazu wird ca. 1/4 Cup Embryonen ebenfalls in PBT reäquilibriert (2 mal 15 min). Anschließend wird der Zweit-Antikörper in PBT/ZS ca. 1:200 verdünnt für 20 min an den Dummies vorinkubiert. In diesem Kurs werden die bereits fertig prä-inkubierten und gebrauchsfertig verdünnten Zweit-Antikörper ausgegeben! Von den Embryonen wird die Blockierlösung abgenommen, und je 500 l Zweit- Antikörperlösung (Endverdünnung AK: 1:1000) zugegeben. Die Inkubation erfolgt für 40 min (Schüttler, leicht bewegen). Anschließend wird der Zweit-Antikörper abgenommen und 3 mal für 10 min mit PBT gewaschen. Während dieser Waschschritte wird der Streptavidin/Peroxidase (=AB-) Komplex angesetzt. Pro Färbung brauchen Sie 500 l ABC-Komplex, mit je 2 l Lösung A und 2 l Lösung B pro 500 l PBT (Vectastain-Kit der Firma Vector). Diese Lösung muss 30 min inkubieren. Anschließend wird das PBT von den Embryonen abgezogen, und pro Färbung je 500 l Komplex zugegeben. Inkubationszeit 30 min. Der Komplex wird für alle Färbungen von den Betreuern angesetzt und als fertige Lösung ausgegeben!! Der Komplex wird abgezogen, und 3 mal 10 min mit PBT gewaschen. 11

12 Farbreaktion PBT abziehen, Zugabe Färbereagens (Für alle Färbungen Stock ansetzen: in PBT je 500 l pro Ansatz + 10 l DAB (siehe Hinweis, GIFTIG; 10 mg/ml) + 2 l NiCl (10% Lösung). Die Färbelösung wird bereits fertig gemischt ausgegeben! (ACHTUNG: DAB = Diaminobenzidin ist giftig, teratogen (= keimschädigend) und möglicherweise carzinogen: Grundsätzlich Handschuhe tragen, alles was mit DAB in Berührung kommt muss mit Klorix dekontaminiert werden nicht die Embryonen!) Zugabe je 500 l Färbereagens, Embryos in Blockschälchen überführen; dazu wird von einer blauen Spitze ca. 1/2 cm vorne abgeschnitten, und damit pipettiert. Die Färbereaktion wird durch Zugabe von 5 l H2O2 (1:100 verdünnt, wird ausgegeben) gestartet. Färbungen unter dem Binokular verfolgen; wenn die Embryonen ausreichend stark gefärbt sind (Betreuer fragen, das sollte nicht länger als 2-3 min dauern), Färbelösung mit einer Pasteurpipette abziehen, in Klorix entsorgen, Blockschälchen mehrfach mit PBT auffüllen und dieses wieder abziehen und ebenfalls in Klorix entsorgen. Die Klorix-Lösung darf nach dem Versuch im Abguss entsorgt werden, da das DAB zerstört ist; vom Klorix selbst gelangen täglich Tonnen ins Abwasser, ist Haushaltsreiniger! Einbetten Zur besseren Auswertung werden die Embryonen in 50% Glycerin eingebettet. Hierzu werden die Embryonen nach dem Abstoppen der Färbung nochmals in ein Eppendorf-Cup überführt (Pipettenspitze abschneiden!!), 2x mit je 1 ml PBT gewaschen, dann nochmals für 15 min in 1 ml PBT unter leichtem Bewegen inkubiert. Auf einem vorher beschrifteten Objektträger werden ca l 50% Glycerin vorgelegt, und die Embryonen zunächst um Eppendorf zu Boden sinken gelassen, und dann wiederum mit einer ca. cm abgeschnittenen blauen Pipettenspitze mit so wenig PBT wie möglich auf den OT transferiert, vorsichtig durchmischt und etwas verteilt, und dann ein 24x32 mm Deckgläschen aufgelegt. Zur Lagerung bis zur Auswertung werden sie waagerecht liegend in Präparatemappen bei 4 o C gelagert. 12

13 Flussdiagramm Sammeln und Fixieren Embryonen mit TNX absammeln, ins Netzchen überführen Dechorionisieren (50% Klorix/TNX), 1-2 min, mit TNX waschen in Eppendorf-Reaktionsgefäß transferieren, l Heptan/500 l FA/PBT 10 min schütteln, Heptan abziehen, 3x500 l Heptan waschen, wässrige Phase und Heptan weitgehend entfernen; +500 l Heptan, 500 l MeOH, 1 min schütteln absinken lassen, abziehen, 3x500 l MeOH waschen; 30 min RT stehen lassen MeOH abziehen, 1 ml PBT zugeben, 1xwaschen, 1x30 min inkubieren abziehen, Zugabe Erst-Antikörper ü. N. Erst-Antikörper abziehen, 1xstrudeln, 1x20 min PBT waschen (parallel DUMMIES für Zweit-AK reäquilibrieren) Blocken: je 500 l 2% ZS/PBT, 20 min (Zweit-Antikörper: 1:200 in 2%ZS/PBT an DUMMIES vorinkubieren) 2%ZS/PBT abnehmen, 500 l Zweit-Antikörper zugeben 40 min inkubieren Zweit-Antikörper abziehen, 3x10 min mit PBT waschen parallel Komplex ansetzen (2 l Lösung A + 2 l Lösung B ad 500 l PBT) Komplex 30 min vorinkubieren PBT von Embryonen entfernen, je 500 l Komplex zugeben 30 min inkubieren Komplex abziehen, 3x10 min mit je 1 ml PBT waschen, PBT abziehen, Zugabe 500 l Färbelösung (PBT + 10 l DAB+ 2 l NiCl 2 ), in Färbeschälchen transferieren, Färbung durch Zugabe von 5 l H 2 O 2 (1:100 verdünnt) starten. 13

14 Praktische Durchführung Ihre Aufgabe besteht darin, an von Ihnen selbst fixierten Embryonen plus der WT-Kontrolle mittels eines spezifischen Antikörpers Mutanten mit mesodermalen Störungen zu identifizieren. Folgender Antikörper wird verwendet: anti-beta3-tubulin: Erkennt den mesoderm-spezifischen beta3-tubulin Isotyp. Es handelt sich um einen in Kaninchen generierten Antikörper gegen die letzten 16 Aminosäuren am C-Terminus des 3-Tubulin-Gens aus Drosophila melanogaster. -Tubuline sind Bestandteil der -Heterodimere die das Grundgerüst der Mikrotubuli bilden. Die 3- Isoform ist insofern von besonderem Interesse, als sie spezifisch in den mesodermalen Derivaten des Embryos exprimiert wird. Sie erlaubt es daher, die Muskulatur des Embryos detailliert zu zeigen und somit auch eventuelle Störungen zu detektieren. Die untenstehende Abbildung zeigt drei Ansichten eines Embryos des Stadiums 16, der mit dem 3-Tubulin-Antikörper inkubiert wurde. Abb. 4: - 3-Tubulin Färbung an Wildtyp Embryonen anterior ventral 14

15 Ansatz des Experiments Jede Gruppe erhält eine Mutante, die mit einem Kürzel gekennzeichnet ist. Abhängig von der Ablagequalität bekommen Sie unterschiedliche Anzahlen an Ablageschälchen, die sie poolen, d.h. die Embryonen in einem Ansatz vereinigen. Parallel erhalten sie eine bereits fertig fixierte Wildtypablage als Kontrolle. Die Embryonen werden wie im Skript angegeben dechorionisiert und fixiert (natürlich nicht die fertige Kontrolle), und dann über Nacht mit dem anti-beta3 Tubulin Antikörper inkubiert (Vorher von den Betreuern die Menge beurteilen lassen, ob es reicht!). Sie erhalten den Erst-Antikörper ( 3-Tubulin, aus Kaninchen) bereits fertig vorverdünnt (Endkonzentration 3-Tubulin 1:5000), sie müssen also nur jeweils 500 l der Erst-AK- Lösung auf ihre Embryonen geben. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 4 o C unter leichtem Bewegen. Am zweiten Tag (siehe Protokoll) benötigen Sie dann den Zweit-Antikörper ( -Kaninchen, biotinyliert, aus Ziege,). Auch dieser ist bereits gebrauchsfertig in PBT/ZS verdünnt (Endkonzentration 1:2000), Sie müssen also auch hiervon nur jeweils 500 l zu ihren Embryonen geben. Nach Einbetten der definitiv gefärbten Embryonen sollen Sie diese zum einen auf Störungen in der Entwicklung des Mesoderms hin analysieren sowie zwecks Dokumentation photographieren. Hierzu steht ein spezielles Photomikroskop mit Digitalkamera zur Verfügung. Jede Gruppe sollte 2-3 repräsentative Embryonen ihres Präparates dokumentieren. Bei alle Photographien gilt es die Standardorientierung des Embryos zu beachten: Anterior immer links, Ventral immer unten! 15

16 Gezielte Gen-Expression in Larven und adulten Tieren in einem hybriden System: Das GAL4-System Für das Verständnis der Rolle und Funktion von Genen in einem Organismus ist es häufig notwendig, durch gezielte Fehl- oder Überexpression das räumliche, zeitliche sowie mengenmäßige Muster des Genprodukts zu manipulieren. Die Schwierigkeit dabei besteht nun darin, diese Manipulation gezielt durchzuführen. Hierbei hat sich ein von Brand und Perrimon entwickeltes Zwei-Komponenten-System als exzellentes Werkzeug für viele Anwendungen gezeigt. Der Ansatz war, einen Transkriptionsfaktor zu finden, der zum einen nicht in der Fliege vorkommt, zum anderen aber dennoch mit der generellen Transkriptionsmaschinerie interagieren kann. Der am besten geeignete Kandidat war der GAL4-Transaktivator aus Hefe. Er bindet mit hoher Spezifität an eine als UAS (upstream activating sequence) bekannte und gut charakterisierte Region im Promotor durch ihn regulierter Gene; ein homologes Protein kommt in der Fliege nicht vor. Transgene Fliegen, die nur diesen Faktor unter der Kontrolle eines beliebigen Promotors tragen, zeigen im allgemeinen keinerlei Auswirkungen dieser Expression, da ja die eigentliche Zielsequenz dieses Faktors im Drosophila-Genom nicht oder zumindest nicht an den notwendigen Promotor-nahen Positionen vorkommt. Wird nun aber ein zu untersuchendes Gen hinter einen Basispromotor kloniert, der zudem die UAS-Elemente enthält, kann dieses nun durch den GAL4-Faktor aktiviert und das entsprechende Genprodukt gebildet werden (Abb 1) zellspezifische Aktivierung GAL4-Gen Drosophila Chromosom Enhancer Enhancer F1 Durch den Enhancer bedingtes Expressionsmuster des GAL4- GAL4- Bindestellen GAL4-Transkriptionsfaktor Transkription Drosophila Chromosom Zu testendes Gen Durch GAL4 wird die Transkription Abb. Das Gal4-UAS System in der Fliege (nach Brand and Perrimon, Development 118, pp , 1993) 16

17 Wird zudem an Stelle eines definierten Promotors eine Strategie angewandt, die das GAL4- Gen durch ungezielte Integration in das Drosophila melanogaster Genom zufällig unter die Kontrolle genomischer Enhancer stellt, ist es möglich, ganze Bibliotheken an Stämmen zu generieren, die eine gezielte Expression in bestimmten Geweben oder Stadien erlauben. Somit ist es also möglich, zu jedem Zeitpunkt der Fliegenentwicklung eine spezifische Überoder Fehlexpression zu bewirken. Der besondere Vorteil besteht nun darin, dass die beiden Konstrukte (das GAL4-Konstrukt, auch als Treiber bezeichnet, sowie das interessierende Gen = Reporter) in zwei getrennten Fliegenstämmen vorliegen können, und sich somit zunächst nicht auswirken können, da GAL4 alleine keine Transkription anschalten kann, zum anderen der Reporter ohne GAL4 ebenfalls inaktiv ist. Erst wenn die beiden Konstrukte durch Kreuzen der beiden Linien in einem Tier zusammengebracht werden, kann die Expression des eigentlichen Gens im Zielgewebe stattfinden (Abb.6). Somit kann man überprüfen, welche Folge z.b. die Expression eines Genes außerhalb seiner eigentlichen Region nach sich zieht (= sog. ektopische Expression). Versuch 3 Nachweis einer Reportergenaktivität in GAL4-UAS-lacZ-Kreuzungen In diesem Versuchsteil soll die gezielte, regulierte Expression von Genen in der Fliege anhand einer Reportergen-Expression demonstriert werden. Kreuzung 1: am ansetzen dpp-gal4 x UAS-LacZ Sie erhalten jeweils eine Fliegenflasche mit Nährbrei, in der Sie virginelle Weibchen einer Linie vorliegen haben (diese dürfen nicht geäthert werden), sowie Flaschen ohne Brei, aus denen Sie sich die fehlenden Männchen für die Kreuzung heraussuchen sollen. Diese werden dann zu den Jungfrauen gesetzt. In der zweiten Woche werden Sie dann aus den 3ten Larven die Imaginalscheiben präparieren und auf -Galactosidase Aktivität analysieren. 17

18 Aufgabe: 1) Präparieren Sie aus Ihren angesetzten Kreuzungen mit den lacz-reportern je drei Larven für die LacZ-Färbung; d.h präparieren in PBS, dann weiter mit dem Protokoll siehe unten. Präparation der Larven Präparation 1. Larven in Blockschälchen mit PBS waschen. Larve in 1 ml PBS in einem Blockschälchen oder auf einem Objektträger in PBS aufpräparieren. Wichtig: Niemals die Präparation ohne Puffer durchführen! Fixieren 1. Die präparierten Gewebe sofort in ein Blockschälchen mit ca. 2 ml 0,7% Glutaraldehyd überführen und ca. 20 min fixieren. Glutaraldehyd abziehen (Vorsicht: Larven nicht mit absaugen!), ca. 1 ml PBT zugeben. 2. 2x Waschen mit je 1 ml PBT. Färbung 3. 1 Die präparierten Gewebe im Blockschälchen mit 1 ml Färbelösung und 25 l 8% X-Gal versetzen und 0,5 bis 1 Std. bei 37 C (Brutschrank) inkubieren x Waschen mit je 1 ml PBT, absaugen und 1 ml 50% Glycerin/PBT zufügen. 3.3 Gewebe in einem Tropfen (ca. 200 l) 50% Glycerin/PBT auf einen Objekträger transferieren und mit einem 24x36 mm-deckglas eindecken. 18

19 Schema: Gewebe und Organe einer Drosophila Larve Zum Präparieren reicht es im Allgemeinen, die Larve am hinteren Ende mit einer Pinzette zu fixieren, am vorderen Ende mit einer zweiten, sehr feinen Pinzette (Dumont #5) am Kopfskelett zu greifen, und vorsichtig die Larve zu zerreißen. Diese Prozedur führt meistens zum Freisetzen der Imaginalanlagen sowie der Speicheldrüsen und des ZNS. 19

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21 Versuch 4 Analyse der Fehlexpression eines Master-Kontroll-Gens in Drosophila melanogaster In diesem Versuchsteil demonstrieren wir die Möglichkeiten, die die Genetik von Drosophila in Verbindung mit molekularbiologischen Techniken bietet. Hierzu kreuzen wir einen Fliegenstamm, der ein entwicklungsrelevantes Gen (eyeless) unter Kontrolle einer UAS- Region enthält, mit einem weiteren, der den Hefe-Transaktivator GAL4 in allen Imaginalanlagen exprimiert. Konsequenz dieser Kreuzung ist, dass das Masterkontrollgen eyeless in allen Imaginalanlagen exprimiert wird und seine Funktion auch außerhalb der natürlichen Expressionsdomäne ausübt. Die phänotypischen Konsequenzen werden in diesem Experiment analysiert. Genotypen der Fliegenstämme BL1553: w[*]; wg[sp-1]/cyo; P{w[+mW.hs]=GAL4-dpp.blk1}40C.6/TM6B, Tb[1] BL6294: y[1] w[*]; P{w[+mC]=UAS-ey.H}UE11 119: UAS-lacZ Kreuzung 2 (wird ausgeteilt) dpp-gal4 x UAS-Eyeless Betrachten sie die Linien nach folgenden Kriterien, und notieren sie sich diese! Augenfarbe und form sowie Aussehen und eventuelle Störungen der Antennen, Beine und Flügel. Stellen sie zudem fest, ob sie eventuelle Störungen in allen Tieren einer Linie beobachten können. 21

22 Puffer und Lösungen für histochemische Färbung (Werden ausgegeben) Färbelösung: 100 ml 10mM Phosphatpuffer, ph μl Triton X-100 (= 0,3%) g NaCl (=150mM) g MgCl2x6 H2O (=1mM) g gelbes Blutlaugensalz: K4[Fe(II) (CN)6] 3 H2O (= 3,1mM) g rotes Blutlaugensalz: K3[Fe(III) (CN)6] (= 3,1mM) 100mg X-Gal 8% X-Gal: (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-beta-D-galactosid) 1,25 ml Dimethylformamid PBS (phosphate buffered saline) Fixierlösung für Larven 130 mm NaCl 7 mm Na 2 HPOP 4 3 mm NaH 2 PO 4 60 μl 25% Glutaraldehyd in 2 ml 0.1M Phosphat-Puffer, ph