Vergleichende Untersuchungen zur Widerstandsfähigkeit von Apis mellifera gegenüber Varroa destructor in Deutschland und Südafrika

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1 Vergleichende Untersuchungen zur Widerstandsfähigkeit von Apis mellifera gegenüber Varroa destructor in Deutschland und Südafrika Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt in der Arbeitsgruppe Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie vorgelegt von Christoph Bosch aus Bochum Bochum Oktober 2015 Referent: Prof. Dr. W. H. Kirchner Korreferent: Prof. Dr. D. Begerow

2 Comparative investigations of the resistance of Apis mellifera to Varroa destructor in Germany and South Africa Dissertation to obtain the degree doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology International Graduate School of Biosciences Ruhr University Bochum Study Group of Behavioural Biology and Didactics of Biology submitted by Christoph Bosch from Bochum Bochum October 2015 Referent: Prof. Dr. W. H. Kirchner Korreferent: Prof. Dr. D. Begerow

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Biologie und Verbreitung von V. destructor Symptomatik des Varroa-Befalls und populationsregulatorische und resistenzbildende Faktoren im Bienenvolk Zielsetzung Untersuchungsgebiete Haplotypisierung von V. destructor und der Einfluss der larvalen Chemostruktur auf das Wahlverhalten der Milbe Einleitung Material und Methoden Haplotypisierung von V. destructor Kutikuläre Kohlenwasserstoffstruktur bei A. m. scutellata und A. m. carnica und deren Einfluss auf das Wirtswahlverhalten von V. destructor Ergebnisse Identifizierung des Varroa-Haplotyps Kutikuläre Chemostruktur von A. m. scutellata und A. m. carnica Wahlverhalten von V. destructor bezüglich L5-Larvenextrakten variabler Herkunft Diskussion Reproduktion und Entwicklung der Varroa-Milbe in der verdeckelten Brut von A. m. carnica und A. m. scutellata Einleitung Material und Methoden Verdeckelungszeit von A. m. carnica und A. m. scutellata Ontogenese von V. destructor in den verdeckelten Brutzellen von A. m. carnica und A. m. scutellata... 37

4 Inhaltsverzeichnis 5.3 Ergebnisse Verdeckelungszeit und Ontogenese von A. mellifera sspp. und V. destructor Diskussion Untersuchungen zum Hygieneverhalten bei A. mellifera Einleitung Material und Methoden Methodenvergleich zum Varroa-gerichteten Hygieneverhalten von A. mellifera Ergebnisse Diskussion Mycoflora von V. destructor und Effekte von ausgewählten Pilzen auf die Überlebenszeit der Milbe Einleitung Material und Methoden Erfassung der mit Varroa assoziierten Mycoflora Einfluss von Pilzisolaten auf die Überlebenszeit von V. destructor Ergebnisse Mycoflora von V. destructor Einfluss von Pilzisolaten auf die Überlebenswahrscheinlichkeit von V. destructor Diskussion Allgemeine Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis... 90

5 1 Einleitung 1 Einleitung Die Westliche Honigbiene Apis mellifera ist eine von mindestens neun Arten innerhalb der Gattung Apis (Hepburn & Radloff 2011), die nach neueren phylogenetischen Untersuchungen auch zehn oder elf Arten umfasst (Arias & Sheppard 2005, Lo et al. 2010). Sie untergliedert sich in etwa 28 Subspezies (Ruttner 1992, Sheppard et al. 1997, Sheppard & Meixner 2003, De la Rúa et al. 2009, Meixner et al. 2011) und ist die einzige Honigbiene, die außerhalb des asiatischen Verbreitungsschwerpunktes der Gattung vorkommt. Von ihrem ursprünglichen Verbreitungsgebiet, dem eurasischen Raum und Afrika, wurde A. mellifera durch die Migration des Menschen in nahezu alle Regionen der Welt verbreitet (Michener 2007). Mit Ausnahme der Antarktis kommt sie heute auf allen Kontinenten vor. Die Westliche Honigbiene wird schon seit vielen Jahrtausenden als Honigproduzent genutzt (vanengelsdorp & Meixner 2010) und hat sich bis heute zum Zentrum einer ganzen Industrie entwickelt. Im großindustriellen Maßstab wird sie in Beuten gehalten, in denen sie in kürzester Zeit an beinahe jeden Ort transportiert werden kann. Neben dem Beitrag der Honigbiene zur Bestäubung von Wildpflanzen ist sie heute für die Bestäubungsleistung in bestäuberabhängigen Kulturen der Agrarindustrie zu einem der wichtigsten Bestäuber geworden (Calderone 2012). Durch die Mobilität der Bienenvölker ist es möglich, diese schnell an die Orte zu liefern, an denen kurzfristig Bestäubungsbedarf besteht. Darüber hinaus lassen sich durch diese Praxis Honigerträge steigern, die höhere Profite versprechen. Durch den globalen Handel treten jedoch auch besondere Schwierigkeiten auf. Weite Transporte über Ländergrenzen und Kontinente hinweg begünstigen die Verschleppung von Krankheiten und sorgen für eine globale Homogenisierung der Honigbienenparasiten (Shutler et al. 2014). Zum einen sind die Honigbienenvölker selbst neuen Krankheiten ausgesetzt, gegen die sie unter Umständen keine Abwehrmechanismen besitzen, zum anderen werden Krankheiten verschleppt, die an den Zielorten die Gesundheit der lokalen Populationen beeinträchtigen. In der Vergangenheit kam es des Öfteren zu Ereignissen, in denen Krankheitserreger auf A. mellifera übergetreten sind oder in Populationen eingeschleppt wurden, in denen sie zuvor nicht vorkamen. Der direkte Kontakt mit Gattungsvertretern im asiatischen Raum sorgte nicht nur einmal dafür, dass ein Artübertritt von Krankheitserregern stattfand. So ist beispielweise heute bekannt, dass der Darmparasit Nosema ceranae von der Östlichen Honigbiene A. cerana auf A. mellifera übergetreten ist (Higes et al. 2006). In der Folge verbreitete sich der Erreger über alle Kontinente, auf denen heute Völker der Westlichen Honigbiene verbreitet sind (Klee et al. 2007, Giersch et al. 2009, Higes et al. 5

6 1 Einleitung 2009). Ein weiteres Beispiel für einen Parasiten in Bienenvölkern der Westlichen Honigbiene ist der Kleine Beutenkäfer (Aethina tumida), dessen Ursprung in Subsahara-Afrika zu finden ist. Aus diesem Lebensraum wurde er unter anderem nach Nordamerika, Australien und Nordafrika verschleppt und befindet sich dort in Ausbreitung (Neumann & Ellis 2008). In Europa ist der Kleine Beutenkäfer erstmals im Jahr 2004 nach Portugal eingeschleppt worden, wo er durch restriktive Maßnahmen wieder beseitigt (Murilhas 2004) und seine Ausbreitung in angrenzende Länder gestoppt werden konnte (Cepero et al. 2014). Einen erneuten Fall der Einschleppung des Kleinen Beutenkäfers nach Europa gibt es aktuell in Italien, wo intensiv versucht wird, der weiteren Ausbreitung entgegenzuwirken (COLOSS 2014, Palmeri et al. 2015). Die Prävention vor Einschleppung und einer weiteren Ausbreitung ist von zentraler Bedeutung im Pestmanagement von neuen Pathogenen der Honigbiene. In den Populationen, die sich als anfällig gegenüber dem neuen Erreger erweisen, treten meist Schadsymptome an den betroffenen Bienenvölkern auf. Die Schadensfolgen können über eine Schwächung bis hin zum Absterben der Völker reichen, wie es durch den Kleinen Beutenkäfer (Neumann & Elzen 2004) und in Einzelfällen auch durch den Darmparasiten N. ceranae (Higes et al. 2008) aufgetreten ist. Betroffene Bienenvölker stehen in der Folgesaison geschwächt und damit eingeschränkt zur Verfügung oder das gesamte Volk stirbt ab. In beiden Fällen kommt es zu wirtschaftlichen Einbußen. Hinsichtlich ökonomischer Folgen und der Haltung der Westlichen Honigbiene hat kein Organismus so nachhaltigen Einfluss wie die Varroa-Milbe. Innerhalb weniger Jahrzehnte hat sie bis heute, ausgehend von ihrem ursprünglichen Verbreitungsschwerpunkt in Asien, nahezu alle Barrieren überwunden und sich beinahe weltweit in den Honigbienenvölkern ausgebreitet. Die Milbe ist in Teilen verantwortlich für den global auftretenden Verlust von Bienenvölkern und die daraus resultierenden ökologischen und ökonomischen Probleme in der Produktion bestäubungsabhängiger Agrarprodukte (Locke et al. 2012b). Es ist heute zum Teil zwingend erforderlich, betroffene Honigbienenvölker gegen die Varroa-Milbe zu behandeln, wofür verschiedene Methoden zur Verfügung stehen (Rosenkranz et al. 2010). Um Schäden von Bienenvölkern abzuwenden, werden auch weiterhin neue Wege der Bekämpfung entwickelt und untersucht. 6

7 1 Einleitung 1.1 Biologie und Verbreitung von V. destructor V. destructor ist einer von vier Vertretern hämatophager Milben innerhalb der Gattung Varroa, mit einer obligat ektoparasitischen Lebensweise in Völkern von Honigbienen (Apis spp.). Die ursprüngliche Wirtsspezies von V. destructor, bevor sie sich in den Völkern von A. mellifera ausbreitete, ist die Östliche Honigbiene Apis cerana. Somit war lange Zeit eine Verbreitung ausschließlich auf den asiatischen Lebensraum beschränkt. V. destructor lebt auf der Östliche Honigbiene sympatrisch mit ihrer Schwesterspezies V. jacobsoni, von der sie erst zu einem späteren Zeitpunkt als eigenständige Art getrennt wurde. Da sich beide Arten morphologisch, bis auf geringe Größenunterschiede, nicht unterscheiden, wurde erst im Jahr 2000 von Anderson und Trueman (2000) erkannt, dass die von Oudemans (1904) beschriebene Art V. jacobsoni sich in zwei Arten aufgliedern lässt und klassifizierten V. destructor als eigenständige Art. Bis vor kurzem wurde angenommen, dass V. destructor als einzige Art befähigt ist, sich in Völkern der Westlichen Honigbiene zu reproduzieren. In Südostasien, wo die Milben und Honigbienen eine lange Zeit nebeneinander koexistieren, wurde kürzlich auch eine Linie von V. jacobsoni entdeckt, die sich erfolgreich in den Völkern der Westlichen Honigbiene reproduziert (Roberts et al. 2015). Die Verbreitung von V. destructor beschränkte sich vor Beginn des internationalen Transports von Bienenvölkern auf die ursprüngliche Wirtsspezies A. cerana. Das Verbreitungsgebiet der Östlichen Honigbiene umfasst den südlichen und südostasiatischen Raum (Ruttner 1992). In diesem Lebensraum evolvierte durch Koadaptationen zwischen beiden Arten ein ausbalanciertes Parasit-Wirt-Verhältnis. Mitte des 18. Jahrhunderts wurden Völker der Westlichen Honigbiene nach Asien importiert, wo sie sich fortan den Lebensraum mit der Östlichen Honigbiene teilten (Oldroyd 1999). Um 1960 wurde erstmals bekannt, dass sich die Varroa-Milbe durch das sympatrische Zusammenleben beider Apis-Arten in den Völkern der Westlichen Honigbiene ausgebreitet hatte (Delfinado 1963, de Guzman et al. 1997). Die initiale Ausbreitung nach Europa und Nordafrika erfolgte wahrscheinlich aus der am südöstlichsten Rand Russlands gelegenen Region Primorje. Von dieser Region aus wurde in den 1960er und 70er Jahren Varroa in weite Teile Europas verschleppt. Nach Amerika gab es mindestens zwei Wege, über die Varroa auf den Kontinent gelangt ist. Eine erste Einschleppung erfolgte womöglich im Jahr 1971 durch den Transport von Bienenmaterial aus Japan nach Paraguay und eine spätere zweite Einschleppung aus Europa (De Jong et al. 1982b, de Guzman et al. 1997). 7

8 1 Einleitung In Regionen, in denen es keine natürlichen Barrieren gab, breiteten sich die Milben nicht nur durch Verschleppung aus. Auch der Verflug von Bienen, denen Milben anhafteten, oder das Beräubern befallener Völker durch milbenfreie Völker sorgten und sorgen noch heute für die interkoloniale Ausbreitung. Die geographischen Barrieren wurden durch den ausgedehnten globalen Handel überwunden, wodurch die Varroa-Milbe auch weit vom Festland abgelegene Inseln erreichte, was die Einschleppung nach Hawaii eindrucksvoll zeigt (Ramadan 2007). In den Völkern der Westlichen Honigbiene hat sich die Milbe bis heute durch ihre rasante Ausbreitung nahezu weltweit etabliert. Es lassen sich nur noch wenige Regionen finden, die vor der Einschleppung der Milbe erfolgreich geschützt werden können. So sind wegen der Einhaltung und der Kontrolle restriktiver Einfuhrbestimmungen Populationen der Westlichen Honigbiene auf Neufundland (Kanada; Shutler et al. 2014) oder auf dem australischen Kontinent noch nicht von der Varroa-Milbe betroffen (Australian Government 2015). Wie im Falle Australiens ist man sich jedoch im Klaren, dass es nur eine Frage der Zeit ist, bis die Milbe eingeschleppt wird (Perrone & Malfroy 2014). Der Lebenszyklus der weiblichen Varroa-Milbe unterteilt sich in eine phoretische und eine reproduktive Phase. Während der phoretischen Phase lebt das Weibchen auf adulten Arbeiterinnen oder Drohnen, an denen sie mittels spezialisierter Strukturen an den Beinen anhaftet (Rosenkranz et al. 2010). In dieser Phase ist es den Milben möglich, in andere Völker zu migrieren. Durch die abgeflachte Körperform kann sich die Milbe für die Nahrungsaufnahme zwischen die Tergite und Sternite schieben. Dort nimmt sie Nahrung auf, indem sie mit ihren spezialisierten Cheliceren in die Intersegmentalmembran sticht, um die Hämolymphe der Biene zu saugen (Delfinado & Baker 1974). Der reproduktive Zyklus beginnt mit dem Eindringen in eine Arbeiterinnen- oder Drohnenbrutzelle. Über die Ammenbienen, die im Brutbereich die Larven versorgen und für die V. destructor eine natürliche Präferenz gegenüber anderen Stadien aufweist (Pernal et al. 2005, Del Piccolo et al. 2010), gelangt die Milbe gezielt zu den Brutzellen und dringt in eine Zelle ein, die kurz vor der Verdeckelung steht. Die Wahl des geeigneten Stadiums geschieht anhand volatiler Substanzen der Larve, welche die Milbe in der Lage ist, olfaktorisch zu perzipieren. Besonders die Kohlenwasserstofffraktion der Kutikula löst bei der Milbe ein verstärktes Verweilverhalten aus (Rickli et al. 1994). Das Bouquet der Larve verändert sich im Laufe der Entwicklung und besitzt im letzten Larvenstadium (L5) eine für die Milbe attraktive Zusammensetzung (Aumeier et al. 2002). Zwischen Arbeiterinnen- und Drohnenlarven unterscheidet sich die Dauer der attraktiven L5-Phase. Dadurch entsteht ein Zeitraum von h vor Verdeckelung der 8

9 1 Einleitung Arbeiterinnenbrut, in dem die Milbe in die Zelle eindringt, der bei Drohnenbrut h beträgt (Boot et al. 1992). Die Varroa-Milbe zeigt eine erhöhte Präferenz für Drohnenbrut (Fuchs 1990), die eine mehr als 11-fach höhere Befallsrate aufweist als Arbeiterinnenbrut. Dies wird u.a. durch die ausgedehntere attraktive Phase der Drohnenbrut verursacht. Während des erweiterten Versorgungszeitraums und durch die höhere Pflegefrequenz tragen die Bienen häufiger Milben an die Drohnenzellen heran, welche dann die Möglichkeit haben einzudringen (Boot et al. 1995, Calderone & Kuenen 2003). Befällt die Milbe eine Zelle, so schiebt sie sich zwischen Zellwand und Larve zum Grund und verbleibt dort bis zur Verdeckelung im Futtersaft (Beetsma et al. 1999). Nach dem Verschließen der Zelle befreit sie sich selbst oder wird durch die weitere Nahrungsaufnahme der Larve frei gefressen (De Jong et al. 1982b, Martin 1994). Die Oogenese wird innerhalb der ersten Stunden der mobilen Phase in der Zelle induziert und ca. 70 h nach Verdeckelung legt die Milbe das erste Ei nahe des Zelldeckels. Aus diesem unfertilisierten, haploiden Ei entwickelt sich durch die haplodiploide Geschlechtsdetermination ein Männchen. Alle folgenden diploiden Eier, aus denen sich Weibchen entwickeln, werden mittig oder am Grund der Zelle im Abstand von ca. 30 h gelegt. Während der Genese durchlaufen die Milben folgende Entwicklungsstadien: Ei/Larve, Protonymphe, Deutonymphe bis zum Adultus. Steiner et al. (1994) zeigten, dass die Milbe ein Ei positioniert, in dem sich ein voll entwickelter Embryo mit von außen sichtbaren vier Beinpaaren befindet. Weist der Embryo bei Eilage dieses morphologische Merkmal nicht auf, so ist er auch nicht weiter lebensfähig (Akimov & Piletskaya 1985). Innerhalb eines Tages nach dem Ablegen des Eis schlüpft die Protonymphe (Steiner et al. 1994), bei der Männchen und Weibchen anhand äußerer Merkmale nicht zu unterscheiden sind. Sie haben einen weißen, eiförmigen Habitus, der ventral drei paarig angeordnete Haare am Sternum aufweist. Diese ermöglichen, da sie schon bei geringer Vergrößerung erkennbar sind, eine einfache Differenzierung zum Folgestadium. Der Übergang von der Protonymphe zur Deutonymphe ist durch eine immobile Phase der Protonymphe gekennzeichnet, an deren Ende die Häutung zur Deutonymphe eintritt. Männchen und Weibchen können in diesem Stadium erstmals morphologisch unterschieden werden. Der Habitus des Männchens ist von weißer, abgerundeter, triangulärer Gestalt und im Vergleich zum Weibchen kleiner und besitzt im Verhältnis zum Körper relativ lange Beine. Das Weibchen weist nach der Häutung einen weißen, runden Körper auf, der zunehmend ovaler wird. Vor der Adulthäutung erscheint die weibliche Deutonymphe in ihrer Form annähernd wie die adulte Milbe mit einem elliptischen Habitus. Das frühe Stadium der Deutonymphe ist von der Form noch nicht deutlich zur 9

10 1 Einleitung Protonymphe abgrenzbar. Hilfreich sind die bereits erwähnten sternalen Haare, die nun in fünf bis sechs Paaren angelegt sind. Das Ende der Entwicklung der Deutonymphe ist ebenfalls durch eine immobile Phase gekennzeichnet. Nach der Adulthäutung weisen die Varroa-Milben im Habitus einen ausgeprägten Sexualdimorphismus auf. Das adulte Weibchen entwickelt eine rötlich braune Färbung, nachdem es zu Beginn noch weiß erschien. Es ist dorsoventral stark abgeflacht und hat eine elliptische Körperform mit µm ± 26.8 (SD) µm Länge und µm ± 41.2 µm Breite (Anderson & Trueman 2000). Das Männchen unterscheidet sich in seinem Erscheinungsbild als Adultus kaum vom Deutonymphenstadium. Es ist µm lang und µm breit (Delfinado-Baker 1984) und färbt sich nach der Häutung durch eine nur schwache Sklerotisierung leicht gelblich (De Jong et al. 1982b, Ifantidis 1983, Steiner 1988). Die Varroa-Milbe zeigt während der reproduktiven Phase auf zweierlei Weise fürsorgliches Verhalten bezüglich ihrer Nachkommen. Um Nahrung aufzunehmen, etabliert die Muttermilbe einen Futterplatz am Abdomen der Bienenpuppe. Sie durchsticht die Kutikula vornehmlich ventral am 5. Abdominalsegment und hält den Futterplatz im weiteren Verlauf der Entwicklung von Puppe und Nachkommen offen. Die Nymphen nehmen an diesem Futterplatz ihre Nahrung auf, was ihnen selbst ohne die mütterliche Fürsorge nicht möglich wäre. Darüber hinaus legt die Muttermilbe durch die Akkumulation des Faeces an einer Stelle einen Kotplatz an. Dieser, meist nahe der Basis der oberen Zellwand lokalisiert, dient den Milben innerhalb der Zelle als Sammelplatz, an dem sich auch die geschlechtsreifen Nachkommen verpaaren (Donzé & Guerin 1994). Durch die Adulthäutung erlangt als erstes das Männchen die Geschlechtsreife. Etwa 210 h nach Verdeckelung durchläuft es diesen Prozess und das erste Weibchen folgt ca. 20 h später (Donzé & Guerin 1994, Martin 1994). Direkt nach der Häutung ist das Weibchen für das Männchen am attraktivsten (Ziegelmann et al. 2013) und sie paaren sich, sobald sie am Kotplatz aufeinander treffen (Donzé & Guerin 1994). Es folgen weitere Weibchen, die das adulte Stadium erreichen, mit denen sich das Männchen paart bis die reproduktive Phase mit dem Schlupf der adulten Biene endet. Die Muttermilbe und ihre adulten Tochtermilben verlassen die Zelle und leben bis zum Eindringen in eine weitere Brutzelle phoretisch. Das Männchen und alle Nymphen, die bis zum Schlupf die Adulthäutung nicht durchlaufen haben, sind außerhalb der Zelle nicht weiter lebensfähig. Eine vollständige Entwicklung zu adulten Nachkommen ist also abhängig von der Länge der Verdeckelungszeit. Diese beträgt bei der Drohnenbrut europäischer Honigbienenrassen 14 bis 15 Tage (Martin 1995) und bei Arbeiterinnenbrut ca. 12 Tage (Jay 10

11 1 Einleitung 1962), wobei am Ende der Verdeckelungszeit aus der Drohnenbrut im Mittel 2 bis 2.2 bzw. aus der Arbeiterinnenbrut 1.45 adulte Tochtermilben hervorgehen (Martin 1994, 1995). 1.2 Symptomatik des Varroa-Befalls und populationsregulatorische und resistenzbildende Faktoren im Bienenvolk Die hämatophage Lebensweise der Milbe hat bei der Biene einen Verlust von Hämolymphe zur Folge und verursacht auf individuellem und auf kolonialem Level ernsthafte Schäden. Während der Entwicklung einer befallenen Bienenpuppe verliert diese durch die Nahrungsaufnahme der Milben kontinuierlich Hämolymphe. Der Verlust resultiert sowohl in einem verringerten Schlupfgewicht der Arbeiterinnen als auch der Drohnen, welches abhängig vom Befallsgrad sowie der der reproduktiven Aktivität ist (De Jong et al. 1982a, Duay et al. 2003). Ein Milbenbefall während der Entwicklungsphase beeinflusst die Lernfähigkeit und die Lebensdauer von Arbeiterinnen negativ (Rosenkranz et al. 2010) und reduziert die Fitness von Drohnen aus mehrfach befallenen Brutzellen (Duay et al. 2002). Durch den Varroa-Befall wird auch die virale Diversität im Bienenvolk positiv beeinflusst (Martin et al. 2012, Muli et al. 2014). Die Varroa-Milbe dient für eine intra- und interkoloniale Verbreitung von Viruserkrankungen der Honigbiene als Vektor. Neben einigen anderen Bienenviren (vanengelsdorp & Meixner 2010) ist sie Vektor für den Deformed Wing Virus (DWV), der beim Saugen der Hämolymphe von infizierten zu nicht infizierten Bienen übertragen wird (Bowen-Walker et al. 1999). Das Vorkommen des DWV korreliert stark mit dem Varroa-Befall. So sind Bienenvölker, die eine hohe Anzahl an Milben aufweisen, häufiger mit DWV befallen. Zudem steigt das Vorkommen betroffener Bienen im Laufe des Jahres stetig an (Francis et al. 2013, Schroeder et al. 2015). Die offensichtlichen Symptome des Befalls sind bei adulten Bienen ein verkürztes Abdomen und verkrüppelte Flügel, wodurch die infizierten Bienen kaum noch einen Beitrag zur Aufrechterhaltung des Volkes leisten können. Im saisonalen Verlauf nimmt der Varroa-Befall in den Bienenvölkern über den Sommer bis in den Herbst stark zu und mit ihm das Auftreten von Sekundärerkrankungen. Symptome wie ein lückiger Brutbereich, verkrüppelte Bienen oder ein Einbruch der Individuenzahl des Bienenvolkes treten durch den starken Befall auf (Rosenkranz et al. 2010). Zum Zusammenbruch kommt es dann meist während des Winters, der durch die Schwächung nicht überstanden wird. 11

12 1 Einleitung Die Ausbreitung der Varroa-Milbe hat besonders auf der nördlichen Hemisphäre starken Einfluss auf die Populationen der Westlichen Honigbiene genommen. Als Folge der Ausbreitung hat es eine Dezimierung der verwilderten Honigbienenvölker gegeben, die bis heute nachwirkt. In Kalifornien beobachteten Kraus und Page (1995) die rasante Ausbreitung der Milbe und dokumentierten den mit ihr verbundenen dramatischen Rückgang verwilderter Völker. In Regionen, in denen Bienenvölker unter der Milbe leiden, ist der heutige Zustand der Populationen, die nicht unter imkerlicher Haltung stehen, weitestgehend unbekannt. Die Imkerei ist seit der Einschleppung der Varroa-Milbe von regelmäßig höheren Völkerverlusten betroffen als vor ihrem Auftreten. Durchschnittliche Völkerverluste in Deutschland liegen bei den Imkern, die sich am Deutschen Bienenmonitoring (DeBiMo) beteiligen, bei 13 % (2009/2010), 11 % (2010/2011), 12 % (2011/2012) und 15 % (2012/2013) (Rosenkranz et al. 2014). Im europäischen Vergleich liegt Deutschland damit etwa im Mittelfeld der mittleren jährlichen Verluste, die je nach Land in den vergangenen Jahren zwischen 4 % und 39 % betrugen (Gray et al. 2010, Mutinelli et al. 2010, The British Beekeepers Association 2014, Zee et al. 2014). Zum Vergleich: Die USA meldeten Auswinterungsverluste die sich auf 34 % (2009/2010), 30 % (2010/2011), 22 % (2011/2012), 31 % (2012/2013) und 23 % (2013/2014) (Lee et al. 2015) beliefen. Im Laufe der Zeit wurden zusätzliche Faktoren wie beispielsweise Pestizide und weitere Krankheitserreger in Betracht gezogen (Neumann & Carreck 2010). Dennoch kommen aktuelle Studien auch immer häufiger zu dem Schluss, dass die Varroa- Milbe den Haupteinfluss auf den Überwinterungserfolg von Honigbienenvölkern ausübt (Dahle 2010, Genersch et al. 2010, Guzmán-Novoa et al. 2010, Schroeder et al. 2015). Interessanterweise stellt sich die Situation in Afrika und Südamerika gegenteilig dar. Das Leben der Honigbienen in den eher tropischen Regionen scheint Anpassungen hinsichtlich regulatorischer Charakteristika gegenüber der Varroa-Milbe zu begünstigen. In Südamerika hat besonders die Afrikanisierte Honigbiene ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber der Varroa- Milbe gezeigt. Sie ist eine Kreuzung aus der in Teilen Subsahara-Afrikas vorkommenden Unterart A. m. scutellata und europäischen Honigbienenrassen. Bei der Afrikanisierten Honigbiene sind möglicherweise Resistenzcharakteristika zusammengekommen, die in den Unterarten, aus denen dieser Hybrid hervorgegangen ist, schon vor der Exposition existiert haben könnten (Martin & Medina 2004). Weil die europäischen Rassen sich weniger durch ihre Widerstandsfähigkeit auszeichnen, tragen sie womöglich kaum mit positiven Eigenschaften zur Regulierung der Milbenpopulation bei. Ganz anders verhält es sich mit der Ostafrikanische Hochlandbiene A. m. scutellata, die den Einzug der Varroa-Milbe in ihr natürliches 12

13 1 Einleitung Verbreitungsgebiet ohne größere Verluste überstanden hat. Allsopp dokumentierte die 1997 erstmals in den Völkern der Kapregion nachgewiesene Milbe (Allsopp et al. 1997, Allsopp 2006) und verfolgte ihre anthropogene Ausbreitung in Südafrika (Allsopp 2004). Innerhalb weniger Jahre hat sich dort V. destructor ausgebreitet, ohne die Population der Honigbiene nachhaltig zu dezimieren (Allsopp 2006). Während sich in tropischen Regionen die Auswirkungen auf Honigbienen in Grenzen halten, werden die Völker nördlicher Breiten stark von den negativen Folgen des Befalls beeinflusst. Ist die Milbe einmal eingeschleppt, bricht ein Bienenvolk innerhalb von 1 3 Jahren ohne eine Gegenbehandlung zusammen (Martin et al. 1998, Rosenkranz et al. 2010). Dies folgt meist auf die hohe Varroa-Belastung im Herbst, wodurch sich eine erhöhte Sterblichkeit von Bienen über den Winter einstellt und die Völker deutlich geschwächt auswintern (Fries et al. 2006, Frey & Rosenkranz 2014). Entgegenwirken kann man dem letalen Verlauf durch eine rechtzeitige Behandlung mit akariziden Wirkstoffen (Liebig 2001). Im Handel ist eine Vielzahl von Akariziden gegen Varroa zu erwerben, dazu zählen Checkmite und Perizin mit Coumaphos oder Apistan und Bayvarol mit Fluvalinat bzw. Flumetrin als aktiver Substanz (Rosenkranz et al. 2010). Da diese Substanzen durch ihre fettlöslichen Eigenschaften Rückstände im Wachs bilden und sich zudem Resistenzen seitens der Milben entwickeln können (Milani 1999, Wallner 1999), greifen andere Anwender auf organische Säuren zurück. Ameisen-, Milch- und Oxalsäure sind wirksame Alternativen und werden nach einem Behandlungskonzept im Jahresverlauf angewendet (Rosenkranz et al. 2010, Toomemaa et al. 2010). Kombiniert werden kann die chemische Behandlung mit nicht-chemischen Methoden, wie dem heute gängigen Entfernen der Drohnenbrut (Calis et al. 1999). Auch Produkte auf der Basis natürlicher Öle, wie Thymovar und Apiguard mit Thymol als aktivem Inhaltsstoff können gegen die Varroa- Milbe eingesetzt werden. Darüber hinaus finden sich viele experimentelle Ansätze mit anderen Ölen pflanzlicher Herkunft wie Neemöl, Knoblauchöl, Nelkenöl, u. a. (Imdorf et al. 1999, González-Gómez et al. 2012, Mahmood et al. 2014, Tananaki et al. 2014). Da auch diese die Gefahr der Rückstandsbildung bieten, sind andere pflanzliche Substanzen mögliche Alternativen, wie beispielsweise Säure aus dem Hopfen (DeGrandi-Hoffman et al. 2012). Eine weitere nicht-chemische Behandlungsalternative zu den teils zeitaufwändigen oder rückstandsbildenden Behandlungen kann die biologische Kontrolle mit antagonistischen Organismen bieten (Chandler et al. 2001). Im Fokus stehen dabei besonders entomopathogene Pilze, die ein aussichtsreiches Potential bieten, als Varroa-Antagonisten zu fungieren. Entomopathogene Pilze werden zur Regulation bei einer Vielzahl von Schadarthropoden 13

14 1 Einleitung angewendet. Hierzu zählen vor allem Hemiptera, Coleoptera und Lepidoptera, für die ein Großteil der ca. 120 kommerziell erhältlichen Biozide auf Pilzbasis geeignet sind (Faria & Wraight 2007). In den Produkten finden sich am häufigsten Isolate von Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae und Lecanicillium spp., deren Einsatz als Kontrollagenzien auch bei V. destructor in Betracht gezogen werden. Neben vielen anderen Isolaten aus Gattungen mit entomopathogenem Potential sind besonders häufig B. bassiana und M. anisopliae untersucht worden. Sie wiesen sowohl in Labor- als auch in Freilandversuchen gute Ergebnisse auf, um die Varroa-Milbe zu kontrollieren (Shaw et al. 2002, Garcia-Fernandez et al. 2008, Rodriguez et al. 2009, Pirali-Kheirabadi et al. 2013). Trotz potentieller Eignung ist noch kein Isolat als Behandlungsmittel gegen die Varroa-Milbe zur Produktreife entwickelt worden. Resistente Honigbienen sind dort von großem Interesse, wo die Varroa-Bekämpfung hohe zeitliche und ökonomische Aufwendungen bedeutet. Obwohl die geringe Anzahl an wilden Honigbienenvölkern der natürlichen Selektion einer resistenten Biene im Weg stehen könnte (Rosenkranz et al. 2010), haben sich an einigen Standorten Völker oder Kleinstpopulationen entwickelt, die anscheinend der Milbe trotzen. Berichte von Völkern aus Frankreich (Le Conte et al. 2007), den USA (Seeley 2007) oder Brasilien (De Jong & Soares 1997) zeigen, dass auch Unterarten europäischen Ursprungs das Potential haben, Resistenzen zu entwickeln. Besonderes Interesse wurde der Primorski-Biene zu Teil, die in der namengebenden Region im Osten Russlands zu finden ist. Sie ist eine europäischstämmige Honigbiene, die im 19. Jahrhundert dorthin verbracht wurde (Crane 1978). Seitdem teilt sie sich nicht nur den Lebensraum mit ihrer Schwesterart A. cerana, sondern auch mit V. destructor, der gegenüber sich während des langen Zeitraums der Koexistenz Resistenzeigenschaften entwickelt haben (Rinderer et al. 2001). Diese widerstandsfähige Linie von A. mellifera wird vor allem in den USA in einem Programm verwendet, das die Züchtung einer resistenten Honigbiene als Alternative zu chemischen Behandlungen vorantreibt (Harris et al. 2002, de Guzman et al. 2007, Rinderer et al. 2010). Ähnliche Projekte laufen in einigen weiteren Ländern wie Deutschland (Büchler et al. 2010), Schweden (Fries et al. 2003) oder Neuseeland (Cox et al. 2005), wobei sie sich jedoch in der Wahl ihrer Ausgangspopulationen unterscheiden. Ein radikales Vorgehen wendete man im Bond-Projekt an, in dem man 150 Varroa-freie Völker auf der Insel Gotland (Schweden) isolierte und sich selbst überließ. Nach anfänglichen Verlusten von bis zu 80 % hat sich in den überlebenden Völkern ein nahezu ausgeglichenes Parasit-Wirt- Verhältnis etabliert, das die Völker bereits seit über 10 Jahren ohne chemische Behandlungen auskommen lässt (Fries et al. 2006, Locke & Fries 2011). Die Dynamik des anfänglichen 14

15 1 Einleitung Rückgangs der Honigbienenpopulation und ihrer anschließenden Erholung wurde auch bereits unter natürlichen Bedingungen der Varroa-Einschleppung in Südafrika (Allsopp 2006) und Tunesien (Ritter 1990, Boecking & Ritter 1993) beschrieben. Dies zeigt, dass die Honigbiene innerhalb weniger Generationen eine Adaptation an die Milbe durchlaufen kann und durch den Selektionsdruck Eigenschaften gefördert werden, die sich positiv auf den Wettbewerb mit Varroa auswirken. Bei den Fragen nach Mechanismen, die das Parasit-Wirt-Verhältnis beeinflussen, wurden Variationen zwischen den Populationen der Varroa-Milbe beobachtet, die zu Spekulationen führten, dass sich unterschiedliche Linien der Varroa-Milbe in der Westlichen Honigbiene ausgebreitet haben (Delfinado-Baker & Houck 1989, Anderson & Fuchs 1998). Bestätigt wurden diese in der Studie von Anderson und Trueman (2000). Sie zeigten, dass sich zwei Linien, der Korea- und der Japan-Typus, in Populationen von A. mellifera ausgebreitet haben. Von den beiden Haplotypen ist der Korea-Typus dominant, was sein weltweites Auftreten betrifft, da das bekannte Vorkommen des Japan-Typus nur auf Amerika und Asien beschränkt ist. Im Zuge der Ausbreitung von V. destructor wurden in Südamerika im Vergleich zu anderen Regionen keine Völkerverluste gemeldet (Carneiro et al. 2007). Durch diesen Umstand wurde vermutet, dass der dort vorkommende Haplotyp einen geringeren Einfluss auf A. mellifera ausübe, sodass ihm eine geringere Virulenz zugesprochen wurde (Rosenkranz et al. 2010). Die Ursachen wurden vor allem in Defiziten bei reproduktiven Eigenschaften des Japan-Typus beschrieben, die sich bis heute jedoch nicht bestätigt haben (Corrêa-Marques et al. 2003, Garrido et al. 2003). Unterschiede im reproduktiven Erfolg zwischen Populationen desselben Haplotyps werden jedoch durch extrinsische Faktoren beeinflusst. Ein wesentlicher Faktor ist die Verdeckelungsdauer der Honigbiene, die zwischen den verschiedenen Unterarten stark variieren kann. Besonders afrikanische weisen gegenüber europäischen Unterarten der Westlichen Honigbiene verkürzte Verdeckelungszeiten auf (Moritz 1985, Martin 1994), was die Anzahl an adulten, begatteten Tochtermilben pro reproduktivem Zyklus reduzieren kann (Büchler & Drescher 1990). Weitere teils unbekannte Faktoren seitens der Honigbiene beeinflussen Fertilität, Fekundität und Mortalität der Varroa-Milbe. So wird beispielsweise in resistenten Völkern der Westlichen Honigbiene ein größerer Anteil an Milben vorgefunden, die sich nicht reproduzieren oder bei denen Männchen zur Begattung der Tochtermilben fehlen (Martin et al. 1997). 15

16 1 Einleitung Auch auf Verhaltensebene lassen sich Anpassungen seitens der Honigbiene finden, welche die Populationsdynamik der Varroa-Milbe beeinflussen. Neben dem Auto- und Allogrooming, bei dem die Milbe vom Bienenkörper entfernt werden kann, spielt vor allem das Hygieneverhalten gegenüber Varroa-befallenen Brutzellen eine wesentliche Rolle (Boecking & Spivak 1999). Bei diesem gehen die Bienen gezielt gegen befallene verdeckelte Brutzellen vor, indem sie diese Zellen öffnen und die Brut entfernen. Die dadurch eintretende Unterbrechung des reproduktiven Zyklus wirkt sich nachhaltig auf die Populationsentwicklung der Varroa-Milbe aus. Das Hygieneverhalten ist in seiner Ausprägung zwischen verschiedenen Linien der Honigbiene hoch variabel, wodurch Völker verschieden intensiv auf befallene Zellen reagieren können. Daher wird die Hygieneleistung auch im Zusammenhang mit einer Varroa-Resistenz gebracht (Spivak & Downey 1998), die durch ihre gute Heritabilität ein geeignetes Kriterium bei der Resistenzzucht ist (Harbo & Harris 1999a). Aus dem Verhaltensspektrum der Varroa-Milbe wird das Wirtsfinde- bzw. Eindringverhalten als ein Faktor diskutiert, der ebenfalls die Widerstandsfähigkeit von A. mellifera positiv beeinflusst (Rosenkranz et al. 2010). Beim Eindringverhalten der Milbe handelt es sich um das Eindringen und Verweilen in Brutzellen mit geeigneten Larvenstadien, welches über wirtseigene Signale vermittelt wird (Rickli et al. 1994, Message & Gonçalves 1995). Dabei sind vor allem volatile Kohlenwasserstoffe beteiligt, die von der Milbe perzipiert werden und eine Entscheidung für oder gegen das Verweilen beeinflussen (Le Conte et al. 1990). Wie auch das Hygieneverhalten scheinen ebenso die Signale, welche die Larvenattraktivität ausmachen, zwischen Populationen der Honigbienen hoch variabel zu sein. Dadurch kommt es bei verschiedenen Linien zu unterschiedlich starken Eindringraten in die jeweiligen Brutzellen (de Guzman et al. 1995). 16

17 2 Zielsetzung 2 Zielsetzung Die Erkenntnisse von natürlich resistenten Populationen der Westlichen Honigbiene liefern einen wichtigen Beitrag zum Verständnis ihrer Resistenzmechanismen bezüglich V. destructor. Bei der resistenten Ostafrikanischen Hochlandbiene, A. m. scutellata, und der anfälligen Europäischen Honigbiene, A. m. carnica, sollen deshalb in Betracht kommende Resistenzfaktoren und darüber hinaus weitere Faktoren, die zu einer positiven Regulierung der Milbenpopulation beitragen können, vergleichend untersucht werden. Besonders von Interesse ist dabei die Ostafrikanische Hochlandbiene mit ihren Anpassungen an die Varroa-Milbe, da sie bis heute vergleichsweise wenig und lückenhaft studiert wurde. Auf A. mellifera haben sich zwei Linien von V. destructor verbreitet, die sich möglicherweise in ihrer Virulenz unterscheiden. Um diesbezügliche Unterschiede in den Merkmalsausprägungen berücksichtigen oder ausschließen zu können, sollen die untersuchten Milbenpopulationen charakterisiert werden. Darüber hinaus soll das Eindringverhalten der Varroa-Milbe untersucht werden. Sie orientiert sich bei diesem u.a. an chemischen Signalen der Larven, die unterschiedlich attraktiv auf die Milbe wirken. In diesem Zusammenhang sollen Analysen zeigen, ob qualitative und quantitative Unterschiede bei der Zusammensetzung der Kohlenwasserstoffe von verdeckelungsreifen L5-Larven bei A. m. carnica und A. m. scutellata bestehen. Anschließend soll das Präferenzverhalten der Milbe bezüglich der rassenspezifischen L5-Larvenextrakte im Verhaltensversuch untersucht werden, um Aufschluss über Unterschiede in der Brutattraktivität zu geben. Zudem soll während der gesamten Verdeckelungszeit der Bienenbrut die Ontogenese der Milbe beobachtet werden. Reproduktionsrelevante Parameter, die zwischen resistenten und nicht-resistenten Populationen der Honigbiene variieren können, sollen dabei vergleichend erfasst werden. Zudem soll das Hygieneverhalten von A. mellifera, welches sich gegen Varroa-befallene Brutzellen richtet, untersucht werden. Verschiedene gängige Methoden zur Erhebung des Hygienegrades, mit dem die Bienen das Hygieneverhalten ausüben, sowie rassenspezifische Ausprägungen sollen dabei verglichen werden. Die Mycoflora der Varroa-Milbe ist bei der Suche nach Antagonisten eine Quelle spezifischer entomopathogener Pilze. Eine genauere Kenntnis über das Vorkommen von Pilzen im Bienenvolk, mit dem Fokus auf Pilze, die in Assoziation mit V. destructor gebracht werden können, liefert einen Pool aus potentiellen biologischen Bioziden und gibt Aufschluss darüber, welchen Pilzen die Milbe kontinuierlich ausgesetzt ist. In Deutschland und erstmalig in Südafrika soll die Untersuchung von Varroa-Milben ein Bild über die Varroa-assoziierte 17

18 3 Untersuchungsgebiete Mycoflora liefern. Anschließend sollen einzelne Isolate ausgewählt und ihr Einfluss auf die Überlebenszeit von V. destructor evaluiert werden. 3 Untersuchungsgebiete Für vergleichende Untersuchungen wurden Versuche sowohl in Südafrika als auch in Deutschland durchgeführt. An der Ruhr-Universität Bochum (RUB) wurden Bienenvölker der Subspezies A. m. carnica genutzt, die an einem Bienenstand im Botanischen Garten der Ruhr- Universität Bochum lokalisiert waren (51 26'38.40"N 7 16'5.34"E). Die Völker wurden jedes Jahr mit Ameisensäure und Oxalsäure gegen Varroa-Milben behandelt, um deren Population zu kontrollieren und Völkerverluste zu vermeiden. Um während der Sommersaison dem Wachstum der Milben entgegenzuwirken, wurde regelmäßig Drohnenbrut entfernt. Die Versuche in Südafrika wurden in den Jahren 2012, 2013 und 2014 in den Spätsommer- Herbst-Monaten Februar, März und April auf der Jackson Field Station (JFS) durchgeführt (25 34'19.00"S 31 10'54.00"E). Bienenvölker der dort verbreiteten Unterart A. m. scutellata stammten von lokalen Imkern und sind vor Versuchsbeginn an einen Bienenstand der Jackson Field Station transportiert worden. Durch die natürliche Widerstandsfähigkeit der Völker gegenüber der Varroa-Milbe wurde seitens der lokalen Imker keine Varroa-Behandlung veranlasst. Die in die Untersuchungen einbezogenen Völker waren somit behandlungsfrei. 18

19 4.1 Einleitung 4 Haplotypisierung von V. destructor und der Einfluss der larvalen Chemostruktur auf das Wahlverhalten der Milbe 4.1 Einleitung Zur heutigen Kenntnis über die Verbreitung von unterschiedlichen Varroa-Linien bei A. mellifera haben Anderson und Trueman (2000) mit ihrer Studie maßgeblich beigetragen. In dieser zeigten sie, dass sich V. destructor in sechs Untergruppen gliedert und ausschließlich zwei von diesen neben A. cerana auch Völker von A. mellifera parasitieren. Namentlich sind diese der Japan-Thailand- und der Korea-Typus. Während der Korea-Typus aus dem östlichen Russland nach Europa, Afrika und Amerika verschleppt wurde, hat sich der Japan-Thailand- Typus nur über die aus Japan nach Paraguay importierte Population in Amerika ausgebreitet (de Guzman et al. 1997, de Guzman et al. 1999, Anderson & Trueman 2000, Solignac et al. 2005). Dadurch, dass in Südamerika, wie beispielsweise in Brasilien, keine Völkerverluste im Zusammenhang mit Varroa auftraten (Carneiro et al. 2007), wurde vermutet, dass sich die Typen in ihrer Virulenz unterscheiden (de Guzman et al. 1998, Anderson & Trueman 2000, Rosenkranz et al. 2010). Weitere Anhaltspunkte lieferten voneinander unabhängige Studien, welche die Reproduktion der Milbe und die Verbreitung der Haplotypen untersuchten. Durch die Hinweise auf den sich in Südamerika ausbreitenden Korea-Typus und gleichzeitige Beobachtungen zu gesteigerten reproduktiven Fähigkeiten der Milben im Zeitraum von etwa 1980 bis 2000 wurde geschlussfolgert, dass dies ein Effekt der Dominanzverschiebung im Vorkommen der Haplotypen sei (Medina & Martin 1999, Carneiro et al. 2007, Strapazzon et al. 2009). Spätere Studien, die versuchten nachträglich den Zusammenhang von Haplotyp und reproduktiven Eigenschaften nachzuvollziehen, fanden keine deutlichen Hinweise auf diese Beziehung (Corrêa-Marques et al. 2003, Garrido et al. 2003). Um die Vergleichbarkeit der Faktoren, die zur Widerstandsfähigkeit gegenüber der Milbe beitragen, zu gewährleisten, ist eine Verifizierung des Haplotyps im besonderen Maße dort sinnvoll, wo die Zusammensetzung der Population unsicher ist. Aus diesem Grund wird eine genetische Charakterisierung einiger Milben angestrebt, die aus den Populationen der Untersuchungsstandorte stammen und deren Ergebnis für die Interpretation der weiteren Versuche von Relevanz ist. 19

20 4.1 Einleitung Ein Verhalten seitens der Milbe, welches von Wirtsfaktoren gesteuert und im Kontext der Widerstandsfähigkeit von A. mellifera genannt wird, ist das Wirtsfinde- bzw. Eindringverhalten von V. destructor (Guzmán-Novoa et al. 1999, Rosenkranz et al. 2010). Im Speziellen bezieht sich dieses auf das Erkennen von geeigneten Bienenlarvenstadien, die vor der Verdeckelung stehen, dem Eindringen in die spezifischen Zellen und dem anschließenden Verweilen bis zur Verdeckelung. Wie bereits oben erwähnt, wiesen Boot et al. (1992) nach, dass für die Milben h und h vor Verdeckelung der Arbeiterinnen- bzw. der Drohnenbrut die attraktive Phase der L5-Larven beginnt. Dabei spielen Kairomone eine Rolle, die von der Larvenkutikula abgesondert werden. Diese scheinen im Fall von aliphatischen Estern attraktiv auf die Varroa-Milbe zu wirken (Le Conte et al. 1989). In absteigender Reihenfolge ihrer Attraktivität sind dies Methylpalmitat, Ethylpalmitat und Methyllinoleat. Sie wurden darüber hinaus als Brutpheromone identifiziert, welche die Verdeckelung der Brutzellen durch die Ammenbienen induzieren können (Le Conte et al. 1990). Heute ist der Beitrag dieser Komponenten bei der Wirtsfindung jedoch umstritten, da Folgestudien zu widersprüchlichen Ergebnissen kamen (Pernal et al. 2005). Als weitere aktive Substanzen wurden kutikuläre Kohlenwasserstoffe von spezifischen Larvenstadien identifiziert, die ein Verweilverhalten der Varroa-Milbe auslösen (Rickli et al. 1994, Donzé et al. 1998). Während der Larvenentwicklung kommt es zu Veränderungen im Profil der kutikulären Kohlenwasserstoffe, wobei gezeigt werden konnte, dass die Zusammensetzung im L5-Larvenstadium für V. destructor am attraktivsten ist (Aumeier et al. 2002). Der Grad der Larvenattraktivität scheint jedoch auch eine genetische Komponente zu besitzen. Guzmán-Novoa et al. (1996) zeigten eine genetische Abhängigkeit der Wahrscheinlichkeit, mit der die Brut von Milben befallen wird. In ihrer Studie in Mexico wies der Hybrid (Afrikanisierte x Europäische Honigbiene) einen 2.7-fach und die Europäische Honigbiene immer noch einen 1.95-fach höheren relativen Milbenbefall auf als die Afrikanisierte Honigbiene. Unterschiede in der Attraktivität der Bienenbrut konnten auch zwischen verschiedenen Linien von A. mellifera außerhalb der tropischen Zone in Nordamerika beobachtet werden (de Guzman et al. 1995). Eine vergleichende chemische Analyse der kutikulären Kohlenwasserstoffe von Aumeier et al. (2002) lieferte zwischen Europäischer und Afrikanisierter Honigbiene kaum deutliche Unterschiede. Sie fanden in derselben Studie jedoch Unterschiede in der L5-Larvenattraktivität der Kohlenwasserstofffraktion, welche von Afrikanisierten Honigbienen gewonnen eine attraktivere Wirkung auf die Milbe ausübte. In invitro-versuchen zeigten die Milben jedoch eine deutliche Präferenz für Larven der Europäischen Honigbiene. 20

21 4.2 Material und Methoden Hier sollen die kutikulären Kohlenwasserstofffraktionen der L5-Larven von A. m. carnica und A. m. scutellata vergleichend untersucht werden. Dabei sollen die Komponenten sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert und die Larvenbouquets bezüglich des Verweilverhaltens der Varroa-Milbe getestet werden. 4.2 Material und Methoden Haplotypisierung von V. destructor Zur Klärung des Haplotyps wurden auf der Jackson Field Station und an der Ruhr-Universität Bochum gesammelte Milben genetisch charakterisiert. An beiden Untersuchungsstandorten wurden für die Analyse adulte weibliche Milben aus Bienenvölkern gesammelt und bis zur Typisierung in 100 % EtOH gelagert. Für die DNA-Isolation wurde ein modifiziertes Protokoll nach Haddad et al. (2007) verwendet, wonach zunächst einzelne Varroa-Milben in ein 500 µl Reaktionsgefäß überführt wurden. Nach Zugabe von 100 µl 10 % Chelex 100-Lösung (Bio-Rad) wurden die Milben mit einem sterilen Pistill homogenisiert und die Suspension für 10 s gevortext. Anschließend wurden die Proben für 15 min bei 56 C im Thermoschüttler (Thermomixer comfort, Eppendorf) inkubiert, anschließend für 15 s gevortext und erneut bei 99 C für 10 min inkubiert. Auf die Inkubation folgte eine Zentrifugation für 10 min bei x g, in deren Anschluss der Überstand in ein neues 500 µl Reaktionsgefäß überführt und bei 26 C gelagert wurde. In der sich anschließenden PCR wurde mittels der von Anderson und Fuchs (1998) entwickelten Primer COX.F (5 -GG(A/G)GG(A/T)GA(C/T)CC(A/T)ATT(C/T)T(A/T)TATCAAC-3 ) und COXRa (5 -CCTGT(A/T)A(A/T)AATAGCAAATAC-3 ) eine Teilregion des Cytochrom-c- Oxidase-Gens der Untereinheit I (COXI) amplifiziert. Die Reaktion erfolgte in einem Ansatz von 20 µl, der mit 2.5 µl DNA-Extrakt, 0.1 mm dntp s, 1 x DreamTaq Puffer, 1 U DreamTaq DNA Polymerase (Thermo Scientific), 2.5 µm je Primer und A. dest. angesetzt wurde. Das Temperaturprogramm im Thermocycler (UNO-Thermoblock, Biometra) war wie folgt programmiert: 94 C für 4 min; 30 Zyklen mit 94 C für 30 s, 55 C für 45 s und 72 C für 55 s; Abschließend erfolgte eine Elongation bei 72 C für 4 min. Durch eine Gelelektrophorese mit einem 1.7%igen Agarosegel bei 120 V für 45 min wurde der Erfolg der PCR überprüft. Anschließend wurden die Proben mit dem E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit 21

22 4.2 Material und Methoden (PeqLab) aufgereinigt und zur Sequenzierung eingeschickt. Die Sequenzdaten lieferte die Firma GATC Biotech AG unter Verwendung des Primers COX.F für die Sequenzierung in eine Richtung. Weitere Editierungen und das Alignment der Sequenzdaten wurde mit dem Programm Geneious 4 (Biomatters Ltd) vorgenommen, wobei für die Alignierung das integrierte ClustalW2 mit Standardeinstellungen verwendet wurde. Um die Zugehörigkeit der Milben zu verifizieren, wurden die Sequenzen mit den in der GenBank des NCBI hinterlegten Sequenzen AF und AF des Korea- bzw. Japan-Thailand-Haplotyps verglichen (Anderson & Trueman 2000) Kutikuläre Kohlenwasserstoffstruktur bei A. m. scutellata und A. m. carnica und deren Einfluss auf das Wirtswahlverhalten von V. destructor Gewinnung des Probenmaterials Zur Extraktgewinnung von L5-Larven wurde sich an den Methoden von Aumeier et al. (2002) orientiert, die hier in leicht abgewandelter Form zur Anwendung kamen. Extrakte wurden von L5-Larven gewonnen, die sich kurz vor der Verdeckelung befanden. Die Larven wurden mit einer Federstahlpinzette aus den Zellen einer Brutwabe entnommen und auf ein Papierhandtuch gelegt. Den Larven anhaftender Futtersaft konnte vom Papier aufgenommen werden. Zudem wurde austretende Hämolymphe leicht erkannt, um verletzte Larven vor der Extraktion zu entfernen. Eine Extraktion von 10 Larven erfolgte durch 3 min Schwenken in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit 3 ml n-pentan (Merck Uvasol). Für die Quantifizierung bei der chemischen Analyse war dem Pentan 1000 ng/3 ml Nonadecansäuremethylester (C20H40O2) als interner Standard beigegeben. Mit einer Glaspipette ist das Extrakt in eine 1.5 ml Gewindeflasche überführt worden. Die Lagerung der gewonnen Extrakte fand bei 20 C im Gefrierschrank statt, bis die Extrakte zeitnah zur Gewinnung durch Evaporation bei Raumtemperatur auf 10 µl eingeengt und der weiteren Verwendung zugeführt wurden. Chemische Analyse Für die Extraktanalyse wurde ein HP 5890 Series II Gaschromatograph verwendet, gekoppelt mit einem HP 5971A Massenspektrometer. Die Ionenquelle arbeitete bei einer Temperatur von 170 C und einer Elektronenenergie von 70 ev. Eine Injektion von 1 µl der zuvor auf 10 µl eingeengten Probe erfolgte mit einem 20:1 Splittverhältnis für 1 min bei einer Injektortemperatur von 280 C. Bei einem konstanten Heliumgasfluss von 1 ml/min erfolgte 22

23 4.2 Material und Methoden die Auftrennung über eine FS-Supreme-5ms-Säule (30 m x 0.25 mm ID; Chromatographie Service GmbH), die wie folgt temperiert wurde: 5 min bei 60 C, mit 12 K/min erhitzt auf 200 C, anschließend mit 2 K/min auf 280 C, abschließend mit 6 K/min auf 300 C und dort für 2 min gehalten. Ausgewertet wurden die Chromatogramme mit den Programmen ChemStation A und OpenChrom 0.9.0, wobei die Peakflächen manuell integriert wurden. Anhand der Peakflächen und des internen Standards wurden die Einzelsubstanz- und Gesamtsubstanzmengen der L5-Larvenextrakte berechnet. Die Bestimmung der Alkane erfolgte zunächst durch den Abgleich von Retentionszeit und Massenspektrum mit einem Alkan-Mix, der eine gerade Anzahl an C-Atomen mit Kettenlängen von C12 C60 enthielt. Über einen Abgleich der Massenspektren mit der Datenbank NIST (Linstrom & Mallard 2014) erfolgte die Identifizierung der ungeraden Alkane. Weitere Substanzen wurden über den Vergleich von Massenspektren und Retentionsindices mit der NIST-Datenbank identifiziert (Linstrom & Mallard 2014). Die Bestimmung der methylierten Substanzen erfolgte zudem anhand der verstärkten Ionen im Massenspektrum, die durch die Fragmentierung der Moleküle an den methylierten Stellen entstehen (Nelson & Carlson 1986, Carlson et al. 1998, Smith et al. 2012). Alkene wurden durch den Abgleich des Molekülpeaks, dem typischen Muster des Massenspektrums und des Retentionsindex bestimmt (Smith et al. 2012). Unterschiede in den relativen Anteilen der einzelnen Substanzen zwischen A. m. carnica und A. m. scutellata sind mit dem Mann-Whitney U-Test für nicht-parametrische Daten von unabhängigen Stichproben verglichen worden. Verwendet wurde dafür das Programm SPSS 22. Zur Visualisierung der Unterschiede zwischen den L5-Larven beider Unterarten wurde eine nicht-metrische Multidimensionale Skalierung (NMDS) angewendet (Clarke & Warwick 2001, Eltz et al. 2005, Reichle et al. 2013). Zuvor sind die Daten der erfassten Komponenten einer Quadratwurzeltransformation unterzogen worden. Anschließend wurden sie standardisiert und der Bray-Curtis-Koeffizient wurde errechnet. Um die Unterschiede im Gesamtprofil der chemischen Komponenten zwischen beiden Unterarten statistisch zu vergleichen, wurde die Bray-Curtis-Matrix auch zur Ausführung einer ANOSIM (one-way) herangezogen. Die NMDS und ANOSIM wurden mit dem Programm Primer 6 (PRIMER-E Ltd) berechnet. 23