Möglichkeiten und Begrenzungen der Belastungsbeurteilung bei Fischen in der tierexperimentellen Nutzung

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1 Möglichkeiten und Begrenzungen der Belastungsbeurteilung bei Fischen in der tierexperimentellen Nutzung Almut Köhler, Ph.D. KIT Sicherheit und Umwelt (), Stabsstelle Zentrale Beauftragte KIT Die Forschungsuniversität in der Helmholtz-Gemeinschaft

2 Warum Belastungsbeurteilungen? Welfare evaluation of genetically modified mice - An inventory study of reports to the Danish Animal Experiments Inspectorate by Rikke Thon, Jesper Lassen, Axel Kornerup Hansen, Inger Marie Jegstrup & Merel Ritskes-Hoitinga Scan J Lab Animal Sci, Vol. 29, % der Stämme zeigen Unwohlsein, 21% davon von geringer Ausprägung und 15% mit starker Ausprägung. 30% der Stämme zeigen gesteigerte Mortalität, Erkrankungsraten und Krankheitsempfänglichkeit. Die häufigsten Veränderungen sind gesteigerte Mortalität, verminderte Fruchtbarkeit und Diabetes. 34% der Fälle benötigen besondere Pflege im Hinblick auf das Wohlbefinden der Tiere. Euthanasie als humaner Endpunkt, Infektionsprophylaxe und heterozygote Zuchtform waren die häufigsten Maßnahmen. Systematische Informationen über Tierschutzaspekte bei genetisch veränderten Tieren ist nicht vorhanden, und es besteht entsprechender Bedarf, diese Informationen durch eine genaue Charakterisierung zu erlangen Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

3 Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates Artikel 3 Definitionen 1. Verfahren bezeichnet jede invasive oder nicht invasive Verwendung eines Tieres zu Versuchszwecken oder anderen wissenschaftlichen Zwecken mit bekanntem oder unbekanntem Ausgang, oder zu Ausbildungszwecken, die bei dem Tier Schmerzen, Leiden, Ängste oder dauerhafte Schäden in einem Ausmaß verursachen kann, das dem eines Kanüleneinstichs gemäß guter tierärztlicher Praxis gleichkommt oder darüber hinaus geht. Dies schließt alle Eingriffe ein, die dazu führen sollen oder können, dass ein Tier in einem solchen Zustand geboren oder ausgebrütet oder eine genetisch veränderte Tierlinie in einem solchen Zustand geschaffen und erhalten wird, schließt jedoch das Töten von Tieren allein zum Zwecke der Verwendung ihrer Organe oder Gewebe aus;... Artikel 17 Ende des Verfahrens (1) Ein Verfahren gilt als beendet, wenn keine weiteren Beobachtungen mehr für das Verfahren anzustellen sind oder wenn bei genetisch veränderten, neuen Tierlinien an der Nachkommenschaft keine weiteren Beobachtungen mehr anzustellen sind oder nicht mehr erwartet wird, dass diese Schmerzen, Leiden oder Ängste empfindet oder dauerhafte Schäden erleidet, die denen eines Kanüleneinstichs gleichkommen oder darüber hinausgehen Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

4 Hintergrund Änderung des Tierschutzgesetzes (TierSchG) auf Grundlage der EU-Direktive 2010/63/EU 7 (2) Nr. 3 TierSchG verlangt bei genetisch veränderten Tieren und Im Fall dass die Nachkommen aufgrund der genetischen Veränderung Schmerzen, Leiden oder Schäden erfahren können: Einstufung von Haltung und Zucht als Projekt (gemäß Artikel 4 der Direktive) Zucht und Haltung bedürfen der Genehmigung Notwendigkeit einer Belastungsbeurteilung einer Zuchtlinie Belastungsbeurteilung für genetisch veränderte Tiere BfR Workshop (2013): Arbeitspapier anwendbar nur für Säugetiere (hauptsächlich Maus) Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

5 BfR Empfehlung Nr. 029/2014 Belastungsbeurteilung bei genetisch veränderten Tieren Was sind genetisch veränderte Tiere? 1. Transgene Tiere 2. knock-out und andere Arten von gentechnischer Modifikation 3. natürlich auftretende oder induzierte Mutanten - Wildtyp-Tiere mit/ohne standardisierten genetischen Hintergrund - Inzucht oder Auszucht-Linien (auch rekombinante) Was ist ein belasteter Phänotyp? Ein Tier, das aufgrund der genetischen Veränderung Schmerzen, Leiden oder Schäden erfahren kann. Definitionen für per se belastete oder nicht belastete Linien Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

6 Welche Linien sind nicht belastet? Linien, in denen die genetische Veränderung durch die Gabe eines Induktors (wie Tamoxifen, Tetrazyklin etc.) ausgelöst wird, so lange der Induktor nicht verabreicht wird. Linien, in welchen die Veränderung des genetischen Phänotyps durch die Gabe eines Repressors über Futter oder Wasser verhindert wird. Reportergene im Genom oder Moleküle, die von diesen Genen herrühren. Immundefiziente Linien, wenn durch Refinement-Maßnahme eine Belastung der Tiere durch die Haltung ausgeschlossen werden kann, indem die Tiere vor Infektionen mit Pathogenen geschützt werden. Linien, wo aufgrund der genetischen Veränderung keine Belastung erwartet wird (Cre-Linien, Flox-Linien) Welche Tiere sind belastet? Linien, die belastende Tumore aufgrund ihrer genetischen Veränderung entwickeln, gelten automatisch als genehmigungspflichtig (auch, wenn die Tumore erst zu einem späteren Zeitpunkt im Leben auftreten). Spontane Mutationen, die selektiv weiter gezüchtet werden sollen, nachdem sie aufgetreten sind und wo Belastungen erwartet werden können, sind genehmigungspflichtig Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

7 Empfohlenes Beurteilungsschema: - Von der Geburt an bis keine weiteren Veränderungen mehr zu erwarten sind / Versuchsende - mindestens 14 Tiere, 7 Männchen, 7 Weibchen von verschiedenen Würfen - Bei der Geburt Anzahl, Farbe, Aktivität, Größe, Milk spot, Pflege durch die Mutter - Beim Absetzen Geschlecht, Gewicht, Veränderungen (haarlose Stellen, schwache Tiere, Bisswunden, Mikrophthalmie, Elefantenzähne, Hydrocephalus) - Alle 3 Monate ab einem Alter von 2 Monaten Ernährungszustand, Körperhaltung, Verhalten, Bewegung, Fell, Körperöffnungen, Reaktionen auf Handling, Gewicht - Abschlussbeurteilung (Ernährungszustand, Haltung, Verhalten, Bewegung, Fell, Körperöffnungen, Tumore, Hautveränderungen, Kannibalismus, Rektumprolaps); Anzahl an Trächtigkeiten, Aufzuchtverluste, Kolonieindex Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

8 Schmerzen, Leiden und Schäden Schmerzen Unangenehme sensorische und emotionale Erfahrung verbunden mit einem realen oder potentiellen Gewebeschaden oder beschrieben als ein solcher. Leiden Beeinträchtigungen, die nicht vom Schmerzbegriff beschrieben werden, die über ein simples Unwohlsein hinausgehen und eine nicht unerhebliche Zeitspanne andauern. Schaden Zustand eines Tieres, der sich vom physiologischen Zustand zum Schlechten unterscheidet und nicht schnell vorbeigeht Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

9 Schmerzen in Fischen Vorhandensein von Nozizeptoren Wege zum ZNS ( ) Prozessierung in höheren Gehirn-Arealen Vorhandensein von Opioid-Rezeptoren und endogenen Opioiden positive Reaktion auf Analgetika ( ) physiologische und Verhaltensänderungen auf Noxen Entwicklung eines Vermeidungsverhaltens ( ) Suspension normaler Verhaltensroutinen Nozizeption: definitiv vorhanden Schmerzempfinden: unklar, Qualität unbekannt aber: Schmerzempfinden ist ein evolutionärer Vorteil! Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

10 Schmerz: Das Problem Fisch Amphibien Primitive Vertebraten Säuger Reptilien Fische Vögel Lindner Biologie Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

11 Das Problem Fisch (Barschartige) (Dorschartige) Knochenfische (Salmoniden, Hechte) (Karpfen, Welse) (Heringe) German.png#/media/File:Vertebrates_prop_German.png (Aale) Lindner Biologie 2 nach Betancourt et al; PLOS Currents Tree of Life, Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

12 Das Problem Fisch andere Physiologie zfin.org Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

13 Das Problem Fisch andere Physiologie andere Sinnesorgane Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

14 Das Problem Fisch andere Physiologie andere Sinnesorgane keine Lautäußerungen Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

15 Das Problem Fisch andere Physiologie andere Sinnesorgane keine Lautäußerungen keine Mimik Nemo Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

16 Probleme bei Fischen Identifizierung von Einzeltieren Möglichkeiten, Techniken, Notwendigkeit Tierzahlen Überblick, Zeitbedarf, Statistik Entwicklung / Zeitpunkt der Geburt Relevanz, Variabilität, Signifikanz Zuchtschemata Identifikation von Trägern, Generationszeit Tiergröße Monitoring-Möglichkeiten Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

17 Erste Fisch -Formulare entwickelt in Berlin, Bad Nauheim, München, Freiburg und Karlsruhe sehr unterschiedliche Ansätze in den unterschiedlichen Einrichtungen um die Vorgaben des BfR an die Unterschiede in Physiologie, Zucht und Haltung anzupassen Unterschiede in den Ansätzen: Anforderungen an die Anzahl an zu beurteilenden Eiern Notwendigkeit der individuellen Identifizierung von Eltern und Nachkommen Startzeitpunkt der Beurteilung der Nachkommen (3 h Tag 5) Beurteilungsparameter bei Embryonen (nur Überlebensrate; Schwimmblase, Morphologie, Verhalten) Beurteilungszeitpunkte bei Adulten (1x mit/ohne Vorgabe zum Alter, 2-3x, alle 3 Monate) Probleme von den lokalen Behörden akzeptiert, aber nicht auf Bundesebene zu spezifisch (nur anwendbar bei Zebrabärblingen), andere Spezies passen nicht zu den Formularen gleiches Ziel, aber unterschiedliche Schwerpunkte Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

18 BfR Workshop am 11. / 12. Juni 2015 Entwicklung einer national standardisierten Belastungsbeurteilung anwendbar für genetisch veränderte Fische (gemäß TierSchG 7 (2) 3) Vergleichbarkeit der Belastungseinschätzung Übertragbarkeit zwischen den Einrichtungen Akzeptanz der Behörden Publikation der Formulare auf der BfR Webseite und in wissenschaftlichen Journalen Die Beurteilung selbst soll den Fisch nicht belasten. Nur Parameter und Stadien werden untersucht, die für eine Belastungseinschätzung relevant sind. sollen benutzerfreundlich, klar, selbsterklärend und auch für Laien verständlich sein zweisprachige Formulare nötig oder in zwei Versionen (Englisch und Deutsch) Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

19 Diskussionsthemen Gesetzliche Themen Definition: Schmerz, Leiden, Schaden, Belastung besonders: Schaden Leiden oder Schmerz Unterschiede GenTG TierSchG Genetik Fische als transgene Tiermodelle: Methoden für die Herstellung; Spezies- Unterschiede in der Entwicklungsgeschwindigkeit; Reproduktionsstrategie (ovipar vs. vivipar etc.) Zeitpunkt der stabilen Integration; Unterschiede in der Definition als etablierte Linie und bei verschiedenen Verfahren welche Generation wird zur Beurteilung herangezogen Einfluss des genetischen Hintergrundes Larven sind nicht genotypisiert! Nur Adulte können genau genotypisiert werden unterschiedliche Tiere beurteilt Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

20 Diskussionsthemen Physiologie Schlupf = zu sehr unterschiedlichen Zeitpunkten Später ist Zustand unabhängig von der Entwicklungsgeschwindigkeit. Geschlechtschromosomen Nach 3-4 Monaten nur noch Größenzunahme bis ca. zum 18. Monat Empfindlichkeit (juvenile Fische schwierig zu fangen, Larven sehr empfindlich) Fokus auf sichtbare Veränderungen Schmerzen, Leiden, Schäden bei Fischen, Nozizeption Kriterien für einen belasteten Fisch: Klinik, Laborparameter, Belastung durch die Beurteilung; Cortisol-Messung im Wasser ist ungenau Ursächlicher Zusammenhang von Stress-Antwort und genetischer Veränderung Größe sehr wenig aussagekräftig, da sie von vielen Faktoren abhängt, die sich zwischen den Labors unterscheiden Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

21 Diskussionsthemen Organisatorische Themen Was soll verglichen werden: Innerhalb der Einrichtung, da sehr verschiedene Bedingungen vorliegen (sonst kann es sein, dass in einer Einrichtung alle Linien oder gar keine belastet sind) gering, mittelgradig, schwer: schwierig zu unterscheiden; aber muss für den Genehmigungsantrag sowieso angegeben werden Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

22 Harmonisierung der Formulare Generell anwendbar für alle Knochenfische keine geschlechtsspezifische Beurteilung Beurteilung zu bestimmten Entwicklungsstadien, nicht an definierten Lebenstagen Verantwortliche Personen Person, die verantwortlich ist für das Projekt oder der Tierhausleiter gemäß 8 oder 11 des TierSchG müssen das Formular unterschreiben TierSchB zeichnet zur Kenntnisnahme Formulare 3 Blätter: Larven, Adulte und Abschlussbeurteilung Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

23 Harmonisierung der Formulare Linien zur Beurteilung: Beurteilung spätestens in der F3 Generation (etablierte Linie) Ausnahmen (nicht genehmigungspflichtig) Induzierbare Linien, bei denen ohne Induktion keine Belastung erwartet wird Heterozygote Reporterlinien Duale Expressionslinien Cre/Lox Linien Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

24 Harmonisierung der Formulare Entwicklungsstadien für die Beurteilung: Larven bei selbstständiger Futteraufnahme geschlechtsreife Tiere normalerweise nicht die identischen Tiere Beurteilungsmethoden: nur durch Adspektion, keine invasiven Maßnahmen Bettina Bert et al., 2016: Considerations for a European animal welfare standard to evaluate adverse phenotypes in teleost fish, EMBO J., Vol. 35; Formulare: tierschg_ html - Empfehlungen Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

25 Kopf der Formulare 1 und Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

26 Die wichtigsten Punkte Formular 1: Beurteilung der Larven Stadium der selbstständigen Futteraufnahme 2 Gelege mindestens, zusammen 20 Tiere Parameter: Morphologie, Schwimmhaltung, Aktivität, sonstiges Formular 2: Beurteilung der Adulten geschlechtsreife Tiere mindestens 7 Individuen von einem Tank Parameter: Körperbau, Flossen, Schuppen, Haut, Kiemen, Verhalten Formular 3: Abschlussbeurteilung Erklärung, warum aufgrund der genetischen Veränderung keine Belastung erwartet wird Zusammenfassung der Beobachtungen aus Formular 1 und 2 Abschlussbeurteilung Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

27 Formular 1: Stadium der selbstständigen Futteraufnahme Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

28 Die wichtigsten Punkte Formular 1: Beurteilung der Larven Stadium der selbstständigen Futteraufnahme 2 Gelege mindestens, zusammen 20 Tiere Parameter: Morphologie, Schwimmhaltung, Aktivität, sonstiges Formular 2: Beurteilung der Adulten geschlechtsreife Tiere mindestens 7 Individuen von einem Tank Parameter: Körperbau, Flossen, Schuppen, Haut, Kiemen, Verhalten Formular 3: Abschlussbeurteilung Erklärung, warum aufgrund der genetischen Veränderung keine Belastung erwartet wird Zusammenfassung der Beobachtungen aus Formular 1 und 2 Abschlussbeurteilung Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

29 Formular 2: Adulte Stadien Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

30 Die wichtigsten Punkte Formular 1: Beurteilung der Larven Stadium der selbstständigen Futteraufnahme 2 Gelege mindestens, zusammen 20 Tiere Parameter: Morphologie, Schwimmhaltung, Aktivität, sonstiges Formular 2: Beurteilung der Adulten geschlechtsreife Tiere mindestens 7 Individuen von einem Tank Parameter: Körperbau, Flossen, Schuppen, Haut, Kiemen, Verhalten Formular 3: Abschlussbeurteilung Erklärung, warum aufgrund der genetischen Veränderung keine Belastung erwartet wird Zusammenfassung der Beobachtungen aus Formular 1 und 2 Abschlussbeurteilung Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

31 Abschlussbeurteilung (1) Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

32 Abschlussbeurteilung (2) Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

33 Messung von Schmerz in Fischen Reflex-basiert nicht unbedingt Schmerz, eher Hypersensitvität emotionale und erlernte Komponenten von Schmerz nicht erfasst Skalierbarkeit zusätzliche Belastung für das Tier Verhaltenstests Hedonistisches Verhalten (Bewegung, Zuckerwasser) Einige Verhaltensweisen aussagekräftiger als andere, abhängig von Fragestellung, Spezies und Umständen Grimace Scales ( Schmerzgesicht ) Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet, Skalierbarkeit Automatisierung der Messung bei einigen Spezies möglich Generelles Verhalten Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet Automatisierung möglich Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

34 Messung von Schmerz in Fischen Reflex-basiert nicht unbedingt Schmerz, eher Hypersensitvität emotionale und erlernte Komponenten von Schmerz nicht erfasst Skalierbarkeit zusätzliche Belastung für das Tier Verhaltenstests Hedonistisches Verhalten (Bewegung, Zuckerwasser) Einige Verhaltensweisen aussagekräftiger als andere, Abhängig von Fragestellung, Spezies und Umständen Wissen in Fischen begrenzt Grimace Scales ( Schmerzgesicht ) Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet, Skalierbarkeit Automatisierung der Messung bei einigen Spezies möglich begrenzte Mimik von Fischen Generelles Verhalten Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet Automatisierung möglich Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

35 Messung von Schmerz in Fischen Reflex-basiert nicht unbedingt Schmerz, eher Hypersensitvität emotionale und erlernte Komponenten von Schmerz nicht erfasst Skalierbarkeit zusätzliche Belastung für das Tier Verhaltenstests Hedonistisches Verhalten (Bewegung, Zuckerwasser) Einige Verhaltensweisen aussagekräftiger als andere, Abhängig von Fragestellung, Spezies und Umständen Wissen in Fischen begrenzt Grimace Scales ( Schmerzgesicht ) Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet, Skalierbarkeit Automatisierung der Messung bei einigen Spezies möglich begrenzte Mimik von Fischen Generelles Verhalten Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet Automatisierung möglich Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

36 Messung von Schmerz in Fischen Generelles Verhalten Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet Automatisierung möglich: idtracker Pérez-Escudero et al., Nature Methods Vol 11 (7), Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

37 Messung von Schmerz in Fischen Generelles Verhalten Daten-intensiv, Zeit-intensiv, Fehler-behaftet Automatisierung möglich: idtracker Pérez-Escudero et al., Nature Methods Vol 11 (7), Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen

38 Versuchstierkundliches Kolloquium Tübingen